Test transformacji limofcytów (LTT)

Lymphocyte Transformation Test (LTT)

Test LTT został opisany w 1960 roku przez Peter’a Nowell(Phytohemagglutinin: An Initiator of Mitosis in Cultures of Normal Human Leukocytes, artykuł dostępny na stronie http://cancerres.aacrjournals.org/content/20/4/462.long).

Obecnie test LTT stanowi czułą metodę, o wysokiej powtarzalności, która znalazła zastosowanie w rutynowej diagnostyce laboratoryjnej różnych chorób.

Wskazania do jego przeprowadzenia obejmują 4 główne obszary diagnostyki medycznej (rozpoznanie lub wykluczenie)(http://www.drandre.eu/resources/LTTEnglisch.pdf):

uwrażliwienie o charakterze komórkowym (alergia typu.IV),wady i zaburzenia czynności układu immunologicznego,

zgodność tkankowa / brak zgodności tkankowej (transplantologia),reaktywność limfocytów na czynniki zakaźne (np. Borelia)

W teście można stwierdzić reakcję limfocytów z antygenami Borrelli w przypadku występowania komórek, które miały kontakt in vivo z prątkami. Autor powyższych informacji powołuje się na artykuł Katarzyny Szatkowskiej (http://hylostet.pl/igm/article/115/) w którym nie znaleziono potwierdzenia tych danych.

Autorka natomiast zwięźle przedstawiła informacje na temat testu transformacji limfocytów, m.in. dotyczące stosowanego nazewnictwa anglojęzycznego (Lymphocyte Transformation Test = Lymphocyte Proliferation Test = Lymphocyte Stimulation Test), a także jego definicję, przedstawiając badanie jako jedno z najbardziej wiarygodnych i czułych metod pozwalających na zmierzenie odpowiedzi proliferacyjnej zaktywowanych antygenem limfocytów.

W artykule autorka podkreśla możliwość wykorzystania testu do wykrywania limfocytów pobudzonych na skutek kontaktu z bakteriami chorobotwórczymi jak na przykład krętki Borrelii

http://www.nucleagena.pl/files/nucleagena_stoma_ltt_na_stom_mat_zastepcze.pdf czy http://www.springerreference.com/docs/ html/chapterdbid/32562.html.

 

Wyniki SI <1 uznaje się za negatywne, wartości pomiędzy 2 a 3 mocno sugerują reakcję dodatnią (inni określają ją jako słabo dodatnią), wartości >3 przyjmuje się za reakcję dodatnią

 

(http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1398-9995.2004.00547.x/pdf),

http://pac.iupac.org/publications/pac/pdf/2004/pdf/7606x1269.pdf.

Użyteczności testu w wykrywaniu aktywnej postaci boreliozy oraz w monitorowaniu leczenia boreliozy poświęcono część doniesienia na stronie http://diagnostykalaboratoryjna.eu/ journal/DL_1-2009__str_97-99.pdf.

Warto też zaznajomić się z wytycznymi Niemieckiego Towarzystwa Boreliozy „Diagnostyka i leczenie boreliozy z Lyme”

Ponieważ komórkowa odpowiedź immunologiczna przebiega bardziej dynamicznie, niż wytwarzanie przeciwciał, test transformacji limfocytów (LTT) może szybciej dostarczyć wskazówki o aktywnej infekcji, przemawiają za tym m.in. takie argumenty:

Dodatni wynik serologiczny nie jest dowodem aktywnej choroby boreliozy z Lyme. Z drugiej strony, negatywny wynik nie wyklucza choroby, zwłaszcza w jej wczesnej fazie.

Jeżeli nie ma dodatniego wyniku w hodowli Borrelia lub metodą PCR, test LTT może dostarczyć wskazówki czy istnieje aktywna choroba, z kolei dodatni wynik LTT jest

podejrzany, ale nie dowodzi aktywnej infekcji.

Wynik testu LTT w kierunku Borrelia jest dodatni już we wczesnym stadium infekcji (także przy obecnym erythema migrans) i zasadniczo jest ujemny lub przynajmniej wyraźnie spada 4 do 6 tygodni po zakończeniu skutecznej antybiotykoterapii.

Wskazania do badania LTT w kierunku Borrelia obejmują:

potwierdzenie istnienia aktywnej infekcji u pacjentów seropozytywnych z niejednoznacznymi objawami / pacjentów z wynikiem negatywnym lub granicznym przy silnym klinicznym podejrzeniu boreliozy z Lyme monitorowanie terapii ok. 4–6 po zakończeniu antybiotykoterapii

monitorowanie w przypadku klinicznego podejrzenia wznowy boreliozy z Lyme nową infekcję

Należy zwrócić uwagę, ze przytoczone powyżej wytyczne różnią się od zaleceń Polskiego Towarzystwa Epidemiologów i Lekarzy Chorób Zakaźnych, opracowanych przez Robert Flisiaka i jego zespół pt. „Diagnostyka i leczenie Boreliozy z Lyme”. W polskich zaleceniach test LTT nie został ujęty jako narzędzie diagnostyczne.

---------------------------------------------------------------------------------------------

Niektóre laboratoria oferują inne metody w celu wykrycia specyficznej dla Borrelia aktywacji limfocytów T, takie jak np. EliSpot-Test-Borrelia®. W tych metodach indukcja syntezy cytokin jest mierzona na poziomie komórkowym. Chociaż test EliSpot ma ugruntowaną pozycję w diagnostyce chorób zakaźnych (TB), jego rola w diagnostyce boreliozy wymaga potwierdzenia przy pomocy innych technik.

---------------------------------------------------------------------------------------------

 

Urszula Rychlik Zakład Analityki i Biochemii Klinicznej Centrum Onkologii, Oddział w Krakowie z5rychli@cyfronet.pl

Andrzej Marszałek Synevo Polska Sp. Z o.o., Warszawa andrzej.marszalek@synevo.pl

Grażyna Sygitowicz Zakład Laboratoryjnej Diagnostyki Medycznej Warszawski Uniwersytet Medyczny

http://www.diagnostykalaboratoryjna.eu/journal/DL_4_425-428.pdf.

https://synevo.pl/dla-pacjentow/biblioteka-pacjenta/test-transformacji-limfocytow-ltt/

--------------------------------------------------------------------------------------------------------

Na rynku dostępne są też inne testy diagnostyczne (test transformacji limfocytów (LTT), test na komórki CD57+NK, oznaczanie przeciwciał w krążących kompleksach immunologicznych, badania kleszcza na obecność bakterii Borrelii), jednak nie są one zalecane do diagnostyki boreliozy ani monitorowania leczenia.

 

Ich wyniki są niewiarygodne ze względu na niską czułość, brak wystandaryzowanych metod i brak badań opublikowanych w recenzowanych czasopismach.

 

Nową metodą diagnostyczną jest badanie przeciwciał przeciwko VlsE – zmiennym antygenom, które pozwalają przetrwać bakterii przez lata w organizmie człowieka, mimo żywej odpowiedzi immunologicznej. Pacjenci chorujący na boreliozę stale produkują przeciwciała skierowane przeciwko VlsE, które mogą być przydatne w diagnostyce. Włączenie tych badań do rutynowej diagnostyki boreliozy z Lyme wymaga standaryzacji metody oraz przeprowadzenia licznych badań potwierdzających jej wartość w postępowaniu klinicznym.

https://synevo.pl/biuro-prasowe/borelioza-2016-fakty-i-mity-14032016/borelioza-z-lyme-choroba-wciaz-tajemnicza/
------------------------------------------------------------------------------------------------------
 

2.5.4 Badanie odpowiedzi komórkowej, test transformacji limfocytów (LTT)

Ponieważ komórkowa odpowiedź immunologiczna (limfocyty, monocyty) przebiega bardziej dynamicznie, niż względnie wolne serologiczne wytwarzanie przeciwciał, test transformacji limfocytów (LTT) może szybciej dostarczyć wskazówki aktywnej infekcji.

Następujące argumenty popierają użycie komórkowych metod immunologicznych w diagnostyce laboratoryjnej boreliozy z Lyme:

1. Dowodem boreliozy z Lyme jest bezpośrednie wykrycie czynnika zakaźnego. Czułość odpowiednich metod jest obecnie technicznie niedoskonała dla codziennego użycia.

2. Dodatni wynik serologiczny nie jest dowodem aktywnej boreliozy z Lyme. Z drugiej strony, negatywny wynik nie wyklucza choroby, zwłaszcza w jej wczesnej fazie, zobacz 2.5.2 przedostatni paragraf.

3. Jeżeli nie ma dodatniego wyniku hodowli Borrelia lub PCR, LTT może dostarczyć wskazówki czy istnieje aktywna choroba(9). Dodatni wynik LTT jest podejrzany, ale nie dowodzi aktywnej infekcji.

4. LTT w kierunku Borrelia jest dodatni nawet we wczesnym stadium infekcji (także przy obecnym erythema migrans) i generalnie jest ujemny lub przynajmniej wyraźnie spada 4 do 6 tygodni po zakończeniu skutecznej antybiotykoterapii.

Wskazania do badania LTT w kierunku Borreli obejmują:

• dowiedzenie istnienia aktywnej infekcji u:

- pacjentów seropozytywnych z niejednoznacznymi objawami

- pacjentów z wynikiem negatywnym lub granicznym przy silnym klinicznym podejrzeniu boreliozy z Lyme

• monitorowanie terapii ok. 4–6 po zakończeniu antybiotykoterapii

• monitorowanie w przypadku klinicznego podejrzenia  boreliozy z Lyme

• nową infekcję

Aby odpowiedzieć  na powyższe pytania niektóre laboratoria oferują inne metody w celu wykrycia specyficznej dla Borrelia aktywacji limfocytów T, takie jak np. EliSpot-Test-Borrelia®.

W tych metodach indukcja syntezy cytokin jest mierzona na poziomie komórkowym. Chociaż test EliSpot ma ugruntowaną pozycję w diagnostyce chorób zakaźnych (TB), jego rola w diagnostyce boreliozy musi zostad potwierdzona przy pomocy odpowiednich technik.
 

http://www.borreliose-gesellschaft.de/Texte/Wytyczne.pdf.

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------
Dr.Wielkoszynski o teście LTT

http://www.wielkoszynski.webity.pl/ilads/

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------

Zastosowania

Ponieważ obecność indukowanych antygenem proliferujących limfocytów pojawia się w określonych sytuacjach patologicznych, jej stwierdzenie znajduje zastosowanie w badaniach medyczno-biologicznych oraz diagnostyce laboratoryjnej.

 Za pomocą LTT można między innymi stwierdzić alergię na leki, co pozwala lekarzowi na zaproponowanie odpowiedniej terapii. Ponieważ test mierzy odpowiedź immunologiczną, stosuje się go również do ustalania zgodności lub braku zgodności tkankowej, informacji niezwykle istotnej w transplantologii.

LTT umożliwia ponadto wykrycie limfocytów pobudzonych na skutek kontaktu z drobnoustrojami chorobotwórczymi, np. krętkami boreliozy. Test stosuje się też do określania tolerancji na tworzywa sztuczne zawarte w protetycznych i stomatologicznych materiałach zastępczych, ponieważ stanowią one potencjalne alergeny.

Przebieg testu

By wykonać test należy pobrać próbkę krwi pacjenta, wyizolować z niej obwodowe limfocyty i monocyty a następnie umieścić je na specjalnych 96-dołkowych płytkach do hodowli komórkowych (w kilku powtórzeniach dla wyższej wiarygodności wyniku). W dalszej kolejności dodaje się testowany antygen. W celu podniesienia swoistości badania wprowadza się również interferon alfa, glutaminę i autologiczną surowicę.

Komórki inkubuje się 6 dni w standardowych warunkach, czyli temperaturze 37°C i 5% CO₂. W tym czasie następuje proliferacja klonalna (namnażanie) zaktywowanych limfocytów. Szóstego dnia, do hodowli dodaje się na 12h znakowaną radioaktywnie ³H-tymidynę, która włączana jest do DNA nowopowstających komórek, dzięki czemu możliwe jest zmierzenie ich ilości za pomocą scyntylometru.

Wynik testu podaje się jako wskaźnik stymulacji SI (z ang. stimulation index), który jest stosunkiem wartości otrzymanej dla hodowli z antygenem i hodowli bez antygenu. Zwykle wynik SI wyższy niż 2 uznaje się za pozytywny.

Testy LTT coraz lepsze

Jakość testów LTT uległa w ostatnich latach znacznej poprawie. Cechują się one obecnie stosunkowo wysoką czułością i swoistością. Wpłynął na to m.in. rozwój technologii mikrokultur oraz aparatów do pomiaru radioaktywności, jak również pojawienie się lepszych mediów hodowlanych i alergenów. Ponieważ test LTT jest metodą diagnostyczną wymagającą nowoczesnego wyposażenia oraz wyspecjalizowanego personelu może być wykonywana jedynie w odpowiednio przystosowanych placówkach.

http://hylostet.pl/igm/article/115/

 

----------------------------------------------------------------------------------------------

LTT

Inaczej test transformacji blastycznej limfocytów. LTT polega na badaniu odpowiedzi limfocytów na antygeny krętkowe in vitro (w warunkach hodowli). Jeżeli pobrany od pacjenta limfocyt miał wcześniej kontakt z krętkiem lub jego antygenami, w trakcie badania wbudowuje w swoje struktury znacznik izotopowy, co prowadzi do uzyskania pozytywnego wyniku.
Przed wykonaniem badania LTT nie należy zażywać antybiotyków przez okres min. 6 tygodni.
Zalety:

• bardzo czuły,
• sprawdza się u chorych seronegatywnych (u których nie udaje się wykryć przeciwciał przeciwkrętkowych w surowicy),
• może być wykorzystany do monitorowania efektów leczenia.

Wady:

• cena (ok. 450 zł).

http://borelia.pl/diagnostyka/

----------------------------------------------------------------------------------------------------
Chorzy o teście LTT

,,Ja dzwoniłem do Berlina i orientowałem się w Instytucie czy "herbal treatment" ma wpływ na wynik LTT i czy są przeciwwskazania do robienia go jeśli jest się na ziołach. Lekarz zajmujący się badaniem LTT powiedział że nie ma jakichkolwiek przeciwwskazań będąc na ziołach i test można robić. ,,

,,,ja mialam robione LTT przed braniem abx,ziol,wynik wyszedl ujemny,mimo ewidentnych objawow w tym rumien,ledwo chodzilam,nawet dyrektor synevo po rozmowie stwierdzil,ze mam ch.odkleszczowe.Powoli dochodze do wniosku ze rumien nie musi koniecznie oznaczac borelioze,coraz czesciej mysle ze bartonella przoduje pod tym wzgledem.Juz mi sie nie chce wydawac kasy na te badania,panele itd.moze kiedys zrobie co jeszcze siedzi we mnie.W kazdym razie badanie LTT nie da odpowiedzi czy bb jest aktywna!w moim przypadku tak bylo mimo objawow....wyszedl minus.,,

,, wykonywałam LTT latem zeszłego roku i dopytując się w labie "co można" a "czego nie można" przed badaniem uzyskałam info, że lepiej wstrzymać się generalnie od wszystkiego. Zioła mogą mieć działanie np. przeciwzapalne, a leków przeciwzapalnych nie można brać przed LTT ,,

http://forum.gazeta.pl/forum/w,26140,129905663,129905663,Badanie_LTT_a_przyjmowanie_ziol.html#p146479265
-------------------------------------------------------------------------------------------------------
IDSA a test LTT

Test LTT, podobnie jak rutynowe odczyny serologiczne, wykonuje się w celu określenia, czy układ odpornościowy miał wcześniej kontakt z drobnoustrojem (w tym przypadku Borrelia spp.).

Jeżeli organizm miał z nim styczność, to w czasie wykonywania testu limfocyty pobrane od pacjenta wbudują znacznik izotopowy, co należy interpretować jako dodatni wynik badania.

Test LTT ma zatem potwierdzić, że kontakt z antygenem miał miejsce w przeszłości, ale nawet wtedy, gdy zostanie uznany za wiarygodny i da wynik dodatni, nie dowodzi czynnej choroby.

Nie ma dobrych testów, które dowodzą czynnego zakażenia.

Pewność można uzyskać po wyizolowaniu żywego krętka od pacjenta, jest to jednak bardzo trudne i kosztowne.

Zgodnie z wytycznymi uznanych towarzystw naukowych, np. rekomendacjami PTEiLChZ, diagnostyka boreliozy z Lyme nadal opiera się na wykorzystaniu dwuetapowej diagnostyki serologicznej.

Na pierwszym etapie wykonuje się test przesiewowy ELISA w celu wykrycia swoistych przeciwciał  w surowicy krwi pacjenta.

Test ELISA jest nawet „zbyt dobry”; należy przez to rozumieć, że z definicji jest to test bardzo czuły, a mniej swoisty, i zakłada nadrozpoznawalność, czyli względnie częste wyniki fałszywie dodatnie, które mogą powodować także inne czynniki, nie tylko zakażenie B. burgdorferi.

Na przykład wykrycie izolowanych przeciwciał w klasie IgM to często wynik fałszywie dodatni, który należy koniecznie potwierdzić.

Drugi etap (oficjalnie zalecany jako potwierdzenie dodatniego wyniku testu ELISA) to test potwierdzenia wykonywany metodą immunoblot, np. test Western Blot lub multiplex.

Dopiero dodatni wynik testu potwierdzenia można traktować jak dodatni wynik obowiązujący. Po szczegóły odsyłam do podanego piśmiennictwa, np. bardzo dobrego artykułu prof. Zajkowskiej i dr Dunaj. Uzyskanie izolowanego dodatniego, potwierdzonego wyniku testów serologicznych u osoby bez objawów chorobowych często się zdarza w polskiej populacji. Według badań polskich może dotyczyć nawet 12% populacji, czyli co około 10. Polaka, i dowodzi styczności z krętkiem Borrelia spp. w przeszłości, natomiast nie umożliwia rozpoznania czynnej boreliozy, która wymaga leczenia. Przeciwciała w klasie IgG mogą być wykrywalne po latach od klinicznej remisji choroby, nawet po wyleczeniu boreliozy. Do rozpoznania boreliozy konieczne jest spełnienie drugiego warunku, czyli występowania objawów klinicznych, które można przypisać tej chorobie. Pacjenci, którzy spełniają powyższe warunki, wymagają leczenia – po szczegóły odsyłam do zaleceń PTEiLChZ.

http://odiagnostyce.pl/2016/09/14/jak-potraktowac-wyniki-niekonwencjonalnych-badan-w-kierunku-boreliozy-u-pacjenta-bez-objawow-klinicznych/

-------------------------------------------------------------------------------------------------
Diagnostyka laboratoryjna

Diagnostykę laboratoryjną stosuje się, gdy na podstawie wywiadu, dolegliwości i obrazu klinicznego stawiane jest rozpoznanie podejrzenie boreliozy.

Diagnostyka obejmuje najczęściej stwierdzenie obecność w krwi specyficznych przeciwciał dla Borrelii (diagnostyka serologiczna). Przeciwciała te pojawiają się z reguły jednak dopiero od 4 do 6 tygodni po infekcji. Jednoznaczne wykrycie swoistych przeciwciał może być często utrudnione z powodu licznych reakcji krzyżowych z innymi antygenami oraz znacznie opóźnionego ich powstawania.

Ze względu na długotrwałe utrzymywanie się obecności we krwi specyficznych dla Borrelii przeciwciał często nie można odróżnić serologicznie aktywnej lub świeżej infekcji od przetrwałego procesu chorobowego

LTT stanowi cenne uzupełnienie diagnostyki

W problematycznych przypadkach (wspomnianych powyżej) dzięki testowi transformacji limfocytów (borrelie LTT) istnieje możliwość oceny komórkowej odpowiedzi immunologicznej na antygeny Borrelii, a tym samym uzupełnienia diagnostyki serologicznej.

LTT dostarcza informacji o aktywności boreliozy

W badaniu LTT ocenia się aktywację uczulonych limfocytów, sppecyficznych dla antygenów Borrelii. W teście,komórki pacjenta inkubowane są z antygenami 3 rodzajów borrelii oraz specyficznym rekombinantem OspC.

Dodatnia reakcja z antygenami Borrelii w LTT wskazuje na aktywną walkę układu odpornościowego z zarazkami. W ten sposób LTT może przyczynić się do wyjaśnienia aktywności boreliozy, której nie można jednoznacznie ocenić metodami serologicznymi.

Test LTT dostarcza jeszcze ważniejszej informacji – czy leczenie antybiotykami (nawet zgodne z zaleceniami) było w pełni skuteczne. W takim przypadku w badaniu

LTT na Borrelie, z reguły po 4 do 6 tygodni od zakończenia terapii uzyskuje się wynik ujemny, podczas gdy specyficzne przeciwciała pozostają obecne we krwi, a ich miano („stężenie”) może nawet wzrastać.

 

http://www.imd-berlin.de/fileadmin/user_upload/patienteninformationen/pl/Borreli%C4%99_LTT_PL.pdf.

---------------------------------------------------------------------------------------------------