Bakteria-kleszcz-kregowce

MOLEKULARNE PODŁOŻE ODDZIAŁYWAŃ POMIĘDZY

BORRELIA BURGDORFERI, KLESZCZEM I KRĘGOWCEM

Dominik Lewandowski1, Anna Urbanowicz1, Marek Figlerowicz1*

1 Pracownia Biologii Molekularnej i Systemowej, Instytut Chemii Bioorganicznej PAN, Poznań

Wpłynęło w maju 2012 r.

1. Wprowadzenie

Kleszcze to pasożyty zewnętrzne, żywiące się krwią wielu gatunków kręgowców. Podczas żerowania kleszcze mogą wprowadzić do organizmu gospodarza różne czynniki chorobotwórcze (bakterie, wirusy, pierwotniaki) wywołujące zoonozy np.: boreliozę, odkleszczowe zapalenie mózgu, tularemię, ehrlichiozę, babeszjozę,czy mykoplazmozę.

 

W ciągu ostatniej dekady nastąpił w Polsce gwałtowny wzrost zapadalności na choroby odkleszczowe, a szczególnie na boreliozę wywoływaną przez krętki Borrelia burgdorferi sensu lato (s. l.). Krążenie B. burgdorferi s. l. w środowisku naturalnym zależy od obecności właściwych wektorów oraz nosicieli.

W Polsce wektorem przenoszącym B. burgdorferi s. l. Są kleszcze z rodzaju Ixodes. W niektórych rejonach Polski do 50% kleszczy może być zakażonych B. burgdorferis. l. [10, 11, 46].

Zachodzące w Europie zmiany klimatyczne i związane z nimi cieplejsze zimy oraz gorętsze i wilgotniejsze lata są jedną z przyczyn ciągłego poszerzania obszarów zasiedlanych przez kleszcze i zwiększania ich liczebności. Jako inne przyczyny wzrostu zapadalności na boreliozę wymienia się rozwój turystyki na terenach leśnych oraz obserwowany w ostatnich latach wzrost populacji dzikich zwierząt. Rozpatrując złożoność ekologicznych i epidemiologicznych uwarunkowań takich chorób jak borelioza, czy kleszczowe zapalenie mózgu,trudno jest jednoznacznie wskazać główną przyczynę ich rozprzestrzeniania.

 

W związku ze wzrastającą liczbą zakażeń krętkami B. burgdorferi s. l., także wśród ludzi, problem powstrzymania dalszej ekspansji tego groźnego patogenu staje się coraz bardziej naglący. Stworzenie skutecznych strategii profilaktyki i terapii boreliozy wymaga jednak lepszego poznania mechanizmów molekularnych procesów zachodzących podczas oddziaływań bakterii, kleszcza i jego gospodarza [5].

2. Borrelia burgdorferi – podstawowe informacje

Krętki z rodzaju Borrelia to Gram-ujemne bakterie o średnicy 0,3–0,5 µm i długości 20–30 µm.

Obecnie znanych jest wiele gatunków należących do tego rodzaju(B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzelii, B. bissettii, B. spielmanii, B. lusitaniae i B. valaisiana).

W Europie gatunki B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzelii traktowane są jako jeden czynnik chorobotwórczy nazywany B. burgdorferi sensu lato (s. l.) [16].

Krętki B. burgdorferi są przenoszone na ludzi głównie przez kleszcze z rodzaju Ixodes. W Europie i Azji są to gatunki: Ixodes ricinus oraz I. persulcatus, w Ameryce Północnej: I. scapularis, a także I. pacificus. W Polsce wektorem przenoszącym B. burgdorferi s. l. jest I. ricinus. Krętki występują także u innych gatunków kleszczy, pewnych gatunków pcheł, much i komarów [36].Wydaje się jednak, że te bezkręgowce nie przenoszą ich na ludzi. Największy rezerwuar bakterii B. burgdorferis.

l. stanowią drobne gryzonie, nieco mniejszy duże ssaki oraz ptaki [16, 46, 51]. Ludzie oraz zwierzęta domowe,u których rozwija się borelioza, są dla krętka przypadkowymi gospodarzami.

 

Mimo iż wszystkie trzy stadia rozwojowe kleszczy mogą żywić się krwią człowieka, do zakażeń ludzi najczęściej dochodzi w wyniku kontaktu z nimfami, które są małymi i trudnymi do zauważenia,a przy tym najbardziej agresywnymi formami rozwojowymi kleszczy [10, 11, 46].

B. burgdorferi s. l. najczęściej zasiedla kleszcze w stadium larwy lub nimfy, podczas ich żerowania na zakażonym krętkiem kręgowcu. Bakteria nie przedostaje się z dorosłej samicy kleszcza na składane przez nią jaja.Kolejne generacje roztoczy są więc zakażane de novo.Naturalny rezerwuar B. burgdorferi stanowią zwierzęta będące kompetentnymi gospodarzami krętka. Do grupy tej należą drobne ssaki oraz ptaki, u których stosunkowo łatwo dochodzi do niegroźnych acz długotrwałych infekcji [37]. Dorosłe kleszcze nie odgrywają znaczącej roli w krążeniu B. burgdorferi w przyrodzie, ponieważ żywią się krwią większych ssaków, które nie są dla bakterii kompetentnym gospodarzem. Niemniej jednak, duże ssaki są ważne dla podtrzymania liczebności kleszczy, ponieważ na ich ciele najczęściej dochodzi do kopulacji kleszczy [37].

Poznany w 1997 roku genom szczepu B31 B. burgdorferi, zawiera ponad 1750genów umiejscowionych na liniowym chromosomie (910 kpz) oraz 21 plazmidach (w sumie ich długość wynosi około 610 kpz) – 12 liniowych (lp –linear plasmid) i 9 kolistych (cp –circular plasmid). Aż 40% informacji genetycznej zakodowana jest w DNA pozachromosomalnym [19]. Badania z użyciem mikromacierzy sugerują, że geny umiejscowione w plazmidach, w większym stopniu niż geny chromosomalne, są zaangażowane w odpowiedź na zmieniające się warunki zewnętrzne [6]. Genom B. burgdorferi koduje około 130 lipoprotein – najwięcej spośród znanych genomów bakteryjnych. Większość z nich stanowią białka powierzchniowe, które biorą udział w różnorodnych oddziaływaniach pomiędzy bakterią a gospodarzem oraz pomiędzy bakterią i wektorem. Duża różnorodność plazmidów, w zależności od szczepu i lokalizacji geograficznej stanowi podstawę klasyfikacji bakterii.

Znaczna część zawartych w plazmidach genów koduje białka nieposiadające homologów u innych organizmów.Prawdopodobnie białka te decydują o wirulencji patogenu. Utrata większości plazmidów nie wywiera wpływu na propagację bakterii w hodowli, jednak uniemożliwia infekowanie zwierząt laboratoryjnych.

 

Znaczny polimorfizm pozagenomowego DNA sprawia, iż łatwo dochodzi do zmian antygenów bakterii, co w dużym stopniu utrudnia diagnostykę i profilaktykę boreliozy.

W materiale genetycznym B. burgdorferi nie zidentyfikowano genów kodujących jakiekolwiek znane toksyny, czy też czynniki potrzebne do ich sekrecji. Uważa się zatem, że uszkodzenia tkanek związane z rozwojem boreliozy są efektem reakcji zapalnej wywołanej przez organizm gospodarza [50].

B. burgdorferi jest obligatoryjnym pasożytem. W związku z tym jej ewolucja, oraz cykl życiowy są ściśle powiązane z ewolucją i sposobem funkcjonowania wektora(bezkręgowca) oraz żywiciela (kręgowca). Przebywanie B. burgdorferi w skrajnie różnych warunkach występujących w organizmach gospodarza oraz wektora wymaga odpowiedniego przystosowania poprzez zmianę profilu ekspresji genów (32).

 

Transkrypcja wielu genów,kodujących białka niezbędne podczas migracji bakterii pomiędzy wektorem i gospodarzem oraz podczas infekcji kręgowców, regulowana jest przez alternatywne czynniki transkrypcyjne Rrp2, RpoN i RpoS. Powstawanie czynnika RpoS kontrolowane jest przez czynnik RpoN (znany również jako σ54 oraz NtrA) wiążący się do polimerazy RNA [43]. Transkrypcja rpoS wymaga przyłączenia kompleksu białkowego w rejonie znajdującym się przed promotorem rpoS. W skład tego kompleksu, oprócz RpoN, wchodzi ufosforylowane białko Rrp2 (Response regulatory protein 2) oraz czynnik BosR (Borrelia oxidative stress regulator; znany również jako Fur) [22, 35]. Ekspresja rpoS jest regulowana potranskrypcyjnie przez krótkie RNA DsrA [28], chaperon RNA – Hfq [27] oraz wiążące RNA białko CsrA [23].Ekspresję wielu genów niezbędnych do kolonizacji wektora uruchamia system złożony z kinazy histydynowej Hk1 (Histidine kinase 1) oraz białka Rrp1. Hk1 i Rrp1 kontrolują produkcję cząsteczki sygnalnej cyklicznegodi-GMP. Nukleotyd ten uczestniczy w modulacji ekspresji genów, których produkty ułatwiają adaptację bakterii do warunków panujących w przewodzie pokarmowym żerującego kleszcza. W przeciwieństwie do ścieżki Rrp2/ RpoN/RpoS uruchamianej tylko przez bakterie znajdujące się w ssącej krew nimfie kleszcza, ścieżka zależna od Hk1 i Rrp1 funkcjonuje zarówno w jelicie żerującej larwy jak i nimfy [7].Ścieżka Rrp2/RpoN/RpoS jest w pełni aktywna także w początkowym stadium infekcji gospodarza przez B. burgdorferi. Uruchamia ona ekspresję genów umożliwiających przetrwanie bakterii w nowym środowisku oraz tłumi ekspresję genów, które były potrzebne do przeżycia B. burgdorferi w kleszczu. Krętki rozprzestrzeniają się w organizmie gospodarza, który w ten sposób staje się swoistym rezerwuarem bakterii. B. burgdorferi może następnie infekować larwy, nimfy i formy dorosłe kleszcza. Larwa może zostać zainfekowana już podczas jej pierwszego żerowania. W momencie, gdy pasożyt jest już syty, ścieżka Rrp2/RpoN/RpoS przestaje być aktywna, a uruchamiana jest ekspresja genów fazy kleszczowej (m.in. OspA, którego transkrypcja jest blokowana przez RpoS) [43]. Jednocześnie, aktywowana jest ścieżka Hk1/Rrp1, która jest niezbędna do kolonizacji jelita larwy [7]. Po przeobrażeniu się larwy w nimfę,krętki narażone są na długotrwały głód. W tym okresie ścieżki Rrp2/RpoN/RpoS oraz Hk1/Rrp1 są nieaktywne.

Ponownie uruchomiona jest ekspresja genów fazy kleszczowej. Rozpoczęcie żerowania przez nimfę kolejny raz aktywuje ścieżkę Rrp2/RpoN/RpoS, co pociąga za sobą transkrypcję genów niezbędnych do zainfekowania kręgowca i jednocześnie stopniowe tłumienie genów fazy kleszczowej [37, 43]. Oprócz tego, dwuskładnikowy układ Hk1/Rrp1 uruchamia transkrypcję genów,których rodukty pozwalają krętkowi uniknąć antybakteryjnej odpowiedzi ze strony kleszcza [24].

3. Kleszcz jako pasożyt

Kleszcze należą do gromady pajęczaków, podgromady roztoczy i są pasożytami zewnętrznymi głównie kręgowców. W Europie najczęściej spotykane są kleszcze z gatunku Ixodes ricinus (kleszcz pospolity). Występują one na terenie lasów liściastych oraz mieszanych.Pomiędzy okresami żerowania kleszcze narażone są na wysychanie i dlatego przemieszczają się do warstwy podściółki. Liczebność populacji I. ricinus ulega znaczącemu obniżeniu, kiedy okres ich aktywności zbiega się z okresem niskiej zawartości wody w atmosferze [35].

Długość poszczególnych faz cyklu życiowego kleszcza zależy od warunków środowiskowych oraz dostępności żywicieli. Kleszcze żerują na ponad 300 gatunkach kręgowców. We wszystkich stadiach rozwojowych żywią się one krwią gospodarza przez kilka kolejnych dni.Jedynie dorosłe samce żerują bardzo krótko i wypijają niewielką ilość krwi. Larwy piją krew przez 2 do 4 dni,nimfy 4–6 dni, natomiast samice 6–10 dni. Po zakończeniu żerowania postać niedojrzała przekształca się w kolejną formę rozwojową. W pełni dojrzałe samice po żerowaniu składają jaja, a następnie umierają. Z jaj rozwijają się larwy, a z nich powstają nimfy, które następnie przeobrażają się w postać dorosłą. Cały cykl rozwojowy trwa zazwyczaj 2 do 3 lat. W skrajnych przypadkach,kleszcze mogą przetrwać w swoim siedlisku nawet do kilku lat. Aby znaleźć żywiciela, kleszcz wspina się na rośliny i oczekuje na bodźce mechaniczne oraz chemiczne, wytwarzane przez gospodarza, po czym spada na ofiarę [35]. W Europie Środkowej okres aktywności kleszczy rozpoczyna się w marcu i trwa do końca października. Jednak najwyższą aktywność I. ricinus wykazuje wczesną wiosną oraz wczesną jesienią [17].

Ze względu na swój pasożytniczy tryb życia kleszcze wykształciły zdolność do pokonywania różnorodnych barier zabezpieczających organizm gospodarza. W tym celu wytwarzają one szereg białek, które szczególnie obficie występują w ślinie tego roztocza. Zidentyfikowano w niej zarówno liczne czynniki przeciwzakrzepowe, jak i rozkurczające naczynia krwionośne, substancje przeciwzapalne oraz immunomodulujące [49].

4. Kolonizacja kleszcza przez B.burgdorferi

Do kolonizacji kleszcza przez B. burgdorferi dojść może podczas jego żerowania na zakażonym kręgowcu.W procesie tym uczestniczą powierzchniowe białka bakterii, między innymi lipoproteina OspA, która oddziałuje z receptorem TROSPA (tick receptor for OspA) obecnym na powierzchni komórek nabłonka jelita kleszcza,oraz lipoproteina OspB, której receptor nie jest znany.Geny ospA oraz ospB umiejscowione są w pozagenomowym DNA krętka, a ich ekspresję indukują bliżej niezidentyfikowane czynniki uwalniane przez kleszcza, bądź gospodarza podczas ukąszenia. W regulacji ekspresji obu genów uczestniczą alternatywne czynniki traskrypcje RpoN/RpoS. Obydwa białka powstają w procesie transkrypcji operonu ospAB [1]. Uzyskane metodą rekombinacji DNA białka OspA i OspB wiążą się specyficznie z tkanką pochodzącą z jelita kleszcza, co potwierdza ich udział w kolonizacji kleszcza przez bakterię. Podczas żerowania kleszcza na myszach, które były wcześniej immunizowane antygenami OspA, a następnie zakażone B. burgdorferi, nie obserwowano wiązania krętków do nabłonka jelitowego roztocza. Mutanty pozbawione operonu ospAB infekują myszy w takim samym stopniu jak typ dziki, nie są jednak w stanie skolonizować kleszcza, ani w nim przetrwać [54]. Wprowadzenie mutacji w genie ospB szczepu B31 B. burgdorferi, przy zachowaniu funkcjonalnego ospA, również ogranicza zdolność infekowania oraz przeżywalność B. burgdorferi w kleszczu [30]. Analiza in vivo transkryptomu B. burgdorferi wykazała, że podczas transferu bakterii z zainfekowanych myszy do żerującego kleszcza następuje wzmożona ekspresja genubb0365 kodującego lipoproteinę La7 [20]. Mutanty pozbawione genubb0365 zakażają myszy w takim samym stopniu jak typ dziki, jednakże mają znacząco obniżoną prze żywalność w organizmie kleszcza. Nie zaobserwowano wzmożonej ekspresji bb0365 w żadnej z kolonii bakteryjnych wyizolowanych z różnych tkanek mysich [32].Ponadto, wykazano, że u pacjentów zakażonych boreliozą immunoglobuliny skierowane przeciwko BB0365 są słabo wykrywalne w testach ELISA [40].

Gdy B. burgdorferi znajdzie się w jelicie kleszcza,musi uniknąć strawienia oraz neutralizacji przez system immunologiczny roztocza. Pomimo, iż trawieniemu kleszcza zachodzi wewnątrzkomórkowo, a proteazy nie są obecne w świetle jelita, produkty pochodzące z degradacji hemoglobiny posiadają właściwości przeciwbakteryjne. Ponadto, znaleziono u kleszcza gen kodujący białko defensyno-podobne, który ulega wzmożonej ekspresji po infekcji jelita przez krętki boreliozy.Nie jest jednak znany sposób, w jaki bakteria omija ten rodzaj odpowiedzi immunologicznej [35].Po nasyceniu się krwią gospodarza niedojrzała forma kleszcza przechodzi przeobrażenie w kolejną formę rozwojową. Jest to proces długotrwały, podczas którego brakuje dostępu do substancji odżywczych. Aby przetrwać ten okres, Borrelia uruchamia produkcję odpowiednich białek. Jednym z nich jest białko Dps-podobne(DNA-binding protein from starved bacteria), będące ortologiem bakterioferrytyny. Białko to zostało pierwotnie zidentyfikowane w komórkach Escherichia coli poddanych długotrwałemu głodzeniu. Stwierdzono,że jego homologi występują u wielu różnych gatunków bakterii. Badania strukturalne wykazały, że białka Dps tworzą dodekamery wykazujące powinowactwo do jonów żelaza oraz DNA. Wiązanie żelaza mogłoby zapobiegać reakcji Fentona, w której powstają reaktywne formy tlenu. UB. burgdorferi homolog Dps powstaje jako produkt ekspresji genu chromosomalnego bb0690.

Wykazano, że białko typu Dps umożliwia B. burgdorferi przetrwanie w jelitach kleszcza długotrwałych okresów głodu [26]. W przeciwieństwie do białka pochodzącego z E. coli, rekombinowane Dps zB. burgdorferi nie wiąże się z DNA, ani nie chroni jego struktury przed uszkodzeniami oksydacyjnymi w testach in vitro. Istnieje jednak szereg homologów Dps, które chronią DNA w inny sposób niż białko pochodzące od E. coli. Bacillus brevis syntetyzuje Dps, w którym nie występuje N-końcowa domena wiążąca DNA, a chromosom bakteryjny jest najprawdopodobniej upakowany pomiędzy tworzące wielowarstwową strukturę dodekamery [41]. Być może B. burgdorferi chroni swój materiał genetyczny upakowując go przy pomocy bogatego w cysteiny, C-końcowego odcinka białka Dps [26]. Inne białko ułatwiające B. burgdorferi przetrwanie w organizmie kleszcza to lipoproteina powierzchniowa BptA (Borrelia persistence in tick protein A). Powstaje ona jako produkt ekspresji genu bbe16 znajdującego się na plazmidzie lp25. Larwy kleszcza zakażone krętkami B. burgdorferi z wyciszonym bptA, po przeobrażeniu do stadium nimfy, zawierały znacząco mniejszą ilość bakterii w porównaniu z krętkami typu dzikiego. BptA wykazuje wysoką konserwatywność (powyżej 88% podobieństwa oraz ponad 74% identyczności na poziomie aminokwasowym) w obrębie szczepów B. burgdorferi s. l. [42].

Po wyczerpaniu glukozy w jelicie kleszcza, B. burgdorferi musi przestawić się na alternatywne źródła węgla potrzebne do glikolizy i syntezy fosfolipidów. U krętków dochodzi wówczas do wzmożonej ekspresji genów z operonu glp, który koduje białka odpowiedzialne za przechwytywanie i wykorzystanie cząsteczek glicerolu wytwarzanych przez kleszcza w czasie zimy. W aktywacji operonu glp uczestniczą czynniki transkrypcyjne Hk1/Rrp1, natomiast wyłączenie glp zachodzi pod wpływem czynnika RpoS [37].

Ponowne pobranie pokarmu przez kleszcza diametralnie zmienia panujące w jelicie warunki. Bakterie odczytują tę zmianę jako sygnał, iż pojawiła się możliwość zasiedlenia kolejnego gospodarza. W rezultacie uruchamiają ekspresję odpowiedniej puli genów. Przez pierwsze 36 godzin żerowania krętki pozostają w jelicie dzięki oddziaływaniu OspA-TROSPA. Po 72 godzinach obserwuje się wykładniczy wzrost populacji B. burgdorferi oraz jej rozproszenie w obrębie tkanki jelita [33,47]. Część krętków przechodzi wtedy przez komórki nabłonka do hemocelu, skąd wędruje dalej do gruczołów ślinowych kleszcza. Migracja krętków nie jest dobrze poznanym procesem. Mogą ją wspomagać interakcje pomiędzy białkami powierzchniowymi bakterii i czynnikami produkowanymi przez kleszcza. Postulowane jest między innymi oddziaływanie powierzchniowej lipoproteiny krętka BBE31 z białkiem TRE31 wydzielanym przez nabłonek jelita podczas żerowania kleszcza [55] oraz wiązanie plazminogenu z OspA [12].Kolejnym bardzo istotnym białkiem pojawiającym się na powierzchni krętka na tym etapie jego cyklu życiowego jest lipoproteina OspC. Gen kodujący OspC stanowi fragment kolistego plazmidu cp26, który występuje u większości szczepów B. burgdorferi [8]. Za regulację ekspresji tego genu odpowiedzialne są czynniki transkrypcyjne RpoN/S. OspC łączy się z występującym w ślinie kleszcza białkiem Salp15 [2] w rezultacie dochodzi do opłaszczenia krętków przez to białko. Rola, jaką pełni OspC w oddziaływaniach bakteria-kleszcz, nie jest do końca jasna. Istnieją przesłanki wskazujące, że OspC jest potrzebne krętkowi do przemieszczenia się z jelita kleszcza do jego gruczołów ślinowych [34]. Knock-out genu ospC powoduje, że B. burgdorferi nie jest w stanie zainfekować ssaka. Efekt ten jest obserwowany zarówno, gdy zakażenie następuje w wyniku ukąszenia przez kleszcza jak i gdy bakteria wprowadzona zostaje za pomocą igły.

Na tej podstawie można sądzić, że białko to jest niezbędne do rozwoju infekcji w organizmie gospodarza [21, 48]. Równocześnie wykazano, że mutanty B. burgdorferi, z wyłączonym genem ospC oraz podwyższoną ekspresją jednego z genów kodujących pozostałe białka powierzchniowe (OspA, OspE, VlsE i DbpA) były w stanie zasiedlić organizm myszy. Okazuje się więc, że inne lipoproteiny powierzchniowe krętka są w stanie przejąć funkcję OspC pod warunkiem, że występują obficie na powierzchni zewnętrznej błony komórkowej bakterii [53]. Lipoproteina BB0323 to kolejne białko występujące w błonie komórkowej B. burgdorferi. Wykazano, że jest ono niezbędne dla przetrwania bakterii w wektorze oraz transferu patogenu z kleszcza do organizmu gospodarza. Produkcja bakteryjnego białka BB0323 wzrasta, gdy zakażony B. burgdorferi kleszcz pobiera krew z organizmu gospodarza. Mutanty pozbawione bb0323 nie są w stanie zainfekować kleszczy, ani myszy. Są one eliminowane w ciągu kilku pierwszych dni infekcji, zarówno u kleszczy, immunokompetentnych myszy, jak i u myszy z zespołem ciężkiego skojarzonego niedoboru odporności. Wykazano również, że zniesienie mutacji bb0323,poprzez tzw. komplementację chromosomalną, powoduje w znacznym stopniu odzyskanie wirulencji i przywraca bakteriom zdolność przetrwania w organizmie myszy oraz kleszcza [55].

Lipoproteina BBA07 stanowi kolejny przykład białka,które ulega zwiększonej produkcji podczas żerowania nimfy oraz odgrywa istotną rolę w przepływie B. burgdorferi z kleszcza do ssaka [52]. U krętków hodowanych w temperaturze 37°C i obniżonym pH (pH 6,8), czyli w warunkach podobnych do tych panujących w jelicie odżywiającego się kleszcza, ekspresja bba07 wzrasta ponad 10-krotnie w porównaniu do kontroli (23°C,pH 7,5). Analizy z użyciem mikromacierzy wykazały,że ekspresja bba07, obok 100 innych genów wirulencji (m.in. ospA, ospC), znajduje się pod kontrolą ścieżki Rrp2/RpoN/RpoS [43]. Stwierdzono, że mutacje rrp2,rpoN lub rpoS powodowały nawet 138-krotny spadek ilości transkryptu bba07 [4, 6, 19]. Mutanty pozbawione BBA07, pomimo, że są w stanie infekować myszy po inokulacji za pomocą igły oraz przeżywają w kleszczu, nie są zdolne do przedostania się do organizmu ssaka poprzez ugryzienie przez kleszcza. Natomiast po komplementacji mutantów za pomocą kopii genu bba07, pochodzącej od typu dzikiego, następuje częściowe odwrócenie tego defektu. Mechanizm działania BBA07 nie został jak dotąd poznany, wiadomo jednak,iż białko to ułatwia przepływ B. burgdorferi z wektora do gospodarza [52].

6. Białka kleszcza wykorzystywane przez B. burgdorferi podczas zakażania organizmu gospodarza

W wyniku koewolucji pomiędzy kleszczem a B. burgdorferi ukształtował się niezwykle specyficzny system oddziaływań. Z jednej strony umożliwia on efektywną kolonizację wektora przez bakterię, z drugiej ułatwia transfer bakterii z kleszcza do gospodarza. Kleszcze,jako pasożyty, niemal do perfekcji doprowadziły zdolność przełamywania systemu obronnego gospodarza,krętki tymczasem nauczyły się jak zdolności te wykorzystywać do własnych celów.

W ślinie kleszczy obficie występują czynniki o działaniu przeciwzakrzepowym rozkurczającym naczynia krwionośne, przeciwzapalnym oraz immunomodulującym [49]. Agregacja płytek krwi prowadząca do utworzenia skrzepu stanowi jeden z krytycznych mechanizmów utrzymujących hemostazę naczyń krwionośnych.

Za inicjację procesu krzepnięcia odpowiedzialne są trombocyty. W wyniku ich aktywacji uwalniane są liczne czynniki białkowe i niebiałkowe niezbędne do powstania skrzepu, m.in. ADP, serotonina, kolagen,trombina, czynnik PAF (platelet-activating factor) oraz tromboksan A2. W ekstrakcie pochodzącym z gruczołów ślinowych kleszcza zidentyfikowano wiele inhibitorów przeciwdziałających agregacji trombocytów in vitro.

Należą do nich m.in. apyraza, czyli enzym hydrolizujący ADP i ATP, a także prostacyklina PGI2 oraz dezintegryny zapobiegające wiązaniu się fibrynogenu z płytkami krwi. Inne antykoagulanty występujące w ślinie kleszcza to inhibitory proteaz typu Kunitza, białka Salp9i Salp14 pochodzące zI. scapularis oraz związki wiążące trombinę i czynnik Xa. Dodatkowo u Haemaphysalis longicornis, należącego do rodziny kleszczy twardych,odkryto białko będące silnym inhibitorem procesu angiogenezy [18]. Substancje te z pewnością w sposób pośredni ułatwiają przenoszonym przez kleszcza drobnoustrojom inwazję organizmu kręgowca.

System odpornościowy gospodarza stanowi kolejną barierę, którą muszą pokonać nie tylko kleszcze, lecz i krętki. W odpowiedzi na uszkodzenie skóry oraz obecność antygenów organizm kręgowca produkuje między innymi cytokiny oraz białka należące do układu dopełniacza.

 

Stwierdzono, że kleszcze z rodziny obrzeżkowatych wytwarzają lipokalinę, która jest inhibitorem konwertazy C5, dzięki czemu blokuje zarówno klasyczną, jak i alternatywną drogę aktywacji dopełniacza[31]. Dowiedziono, że ślina I. scapularis hamuje działanie neutrofilów oraz dezaktywuje anafilatoksyny [18].Wykazano, że ekstrakt gruczołów ślinowych kleszcza hamuje wydzielanie przez makrofagi oraz komórki dendrytyczne cytokin wywołujących zapalenie (IL-1,IL-12 i TNF-α) [9, 38]. Podobne działanie śliny kleszcza, czyli blokowanie produkcji IL-2 i TNF-γ obserwowano w przypadku limfocytów [18]. UI. ricinus opisano białko Iris (I. ricinus immunosuppressor), które także hamuje produkcję cytokin prozapalnych [25]. Jednym z białek kleszczowych blokujących dopełniacz, a wykorzystywanych przez B. burgdorferi, jest Salp20. Homologiczne białka IRAC I i IRAC II, hamujące alternatywną ścieżkę ludzkiego dopełniacza odkryto u I. ricinus [13,14]. W testach in vitro wykazano, że Salp20 zapobiega lizie wrażliwych na serum szczepów B. burgdorferi. Możliwe jest zatem, że białko to chroni bakterię przed dopełniaczem, nie tylko w trakcie jej transferu z gospodarza do wektora, ale także we krwi już pobranej i znajdującej się w jelicie kleszcza [35]. Inne białko I. ricinus, Salp15,blokuje produkcję IL-2, przez co uniemożliwia aktywację limfocytów T CD4. Białko to oddziałuje z opisaną wcześniej lipoproteiną powierzchniową B. burgdorferi OspC.

 

Dzięki temu oddziaływaniu bakterie mogą bez przeszkód wnikać do organizmu żywiciela, gdyż na ich powierzchni tworzy się ochronny płaszcz z białka Salp15, który chroni je przed przeciwciałami rozpoznającymi białko OspC. Co więcej, zachodzące oddziaływanie pomiędzy OspC i Salp15 może być korzystne również dla kleszcza. Wykazano bowiem, że B. burgdorferi indukuje powstawanie większych ilości białka Salp15, dzięki czemu skuteczniej blokowany jest układu odpornościowy.

 

W konsekwencji kleszcz posiada lepsze warunki do żerowania [39]. Kolejne białko wytwarzane w śliniankach i jelicie kleszcza, Salp25D, jest homologiem peroksyredoksyn i należy do rodziny tioredoksyno-zależnych peroksydaz [29]. Białka tego typu występują powszechnie u organizmów żywych i odpowiedzialne są za enzymatyczną dezaktywację m.in.nadtlenku wodoru. Wykazano, że Salp25D skutecznie wymiata wolne rodniki tlenowe produkowane przez zaktywowane neutrofile, chroniąc w ten sposób B. burgdorferi przed stresem oksydacyjnym [15]. Wyciszenie ekspresji Salp25D w śliniankach kleszcza znacząco redukuje liczbę krętków w roztoczach po tym, jak spożyły one krew myszy zainfekowanych B. burgdorferi. Badania myszy immunizowanych Salp25D i zainfekowanych krętkiem wykazały, że immunoglobuliny skierowane przeciwko Salp25D blokują napływ krętków do kleszczy. Ciekawym wydaje się również fakt, iż wyciszenie salp25D w śliniankach hamuje przepływ B. burgdorferi do kleszcza, podczas gdy wyciszenie tego genu w jelicie nie wywołuje analogicznego efektu. Wynik powyższego doświadczenia sugeruje, że Salp25D odgrywa istotną rolę w miejscu ukąszenia przez kleszcza [29].

 

Powstrzymanie u gospodarza reakcji wywołującej ból i swędzenie może być jednym z istotnych czynników decydujących o powodzeniu strategii pasożytniczej kleszcza.

 

Jednym z pierwszych mediatorów bólu jest ATP uwalniany z uszkodzonych komórek. Wykazano, że ślina kleszczy zawiera enzymy degradujące ATP. Obok ATP, bradykinina jest kolejnym związkiem pośredniczącym w wywoływaniu poczucia bólu. Dowiedziono,że bradykinina jest degradowana przez występującą w ślinie kleszcza kininazę [18]. Serotonina i histamina uwalniane przez trombocyty i komórki tuczne również indukują powstawanie bólu, a także zwiększają przepuszczalność naczyń krwionośnych. U kleszczy z rodzaju Dermacentor wykryto białko SHBP (serotonine and histamine binding protein) wiążące obydwa wyżej wymienione związki [44]. Efekt wazodylatacji, czyli rozkurczu mięśni gładkich w ścianie naczyń krwionoś nych,umożliwia kleszczowi efektywniejsze ssanie krwi. W ślinie kleszcza znaleziono prostaglandyny PGE2 i PGF2α,które działają jak substancje wazodylatacyjne [45].

Dodatkowo, związki te podnoszą ciśnienie krwi w kapilarach, co w połączeniu z większą przepuszczalnością naczyń skutkuje intensywniejszym napływem krwi do tkanki w miejscu ugryzienia [18]. Nie odkryto do tej pory czynników bakteryjnych uwikłanych w bezpośrednie oddziaływania z tą grupą białek kleszcza, jednak działanie czynników łagodzących ból czy wazodylatacyjnych z pewnością wpływa korzystnie na proces infekcji kręgowca przez B. burgdorferi.

6. Podsumowanie

Oddziaływania pomiędzy krętkami B. burgdorferi,kleszczami i kręgowcami stanowią niezwykle interesujący i skomplikowany przykład wzajemnego dopasowania pomiędzy pasożytem, wektorem i żywicielem.

W ciągu minionych 30 lat nastąpił duży postęp w identyfikacji substancji produkowanych przez gruczoły ślinowe kleszcza, które ułatwiają mu żerowanie. Cząsteczki te współgrają ze sobą w celu ominięcia systemu obronnego kręgowca. Pasożyt reguluje dopływ krwi do miejsca ugryzienia w taki sposób, aby pobrać jak największą ilość pożywienia, a jednocześnie nie uruchomić odpowiedzi układu immunologicznego gospodarza. B. burgdorferi,a także inne drobnoustroje chorobotwórcze wykorzystują immunomodulacyjne właściwości śliny kleszcza,aby skuteczniej infekować ssaka. Rosnąca wiedza o tych procesach i czynnikach, które w nich uczestniczą stwarza dużą szansę na stworzenie nowych efektywnych metod ograniczających rozprzestrzenianie się zarówno kleszczy jak i roznoszonych przez nie patogenów [35].

Artykuł powstał w wyniku realizacji grantu MNiSW N N302 041536 oraz Programu MPD „Structural biology of plants and microbes”, finansowanego ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego i z budżetu państwa.

Link do orginalu : http://www.pm.microbiology.pl/web/archiwum/vol5212013009.pdf.

Piśmiennictwo

1. Alverson J., Bundle S.F., Sohaskey C.D., Lybecker M.C.,

Samuels D.S.: Transcriptional regulation of the ospAB and

ospC promoters from Borrelia burgdorferi. Mol. Microbiol. 48,

1665–1677 (2003)

2. Anguita J., Fikrig E. i wsp.: Salp15, an Ixodes scapularis salivary

protein, inhibits CD4_ T cell activation. Immunity, 16, 849–859

(2002)

3. Blevins J.S., Xu H., He M., Norgard M.V., Reitzer L., Yang X.F.:

Rrp2, a σ54-dependent transcriptional activator of Borrelia

burgdorferi, activates rpoS in an enhancer-independent man-

ner. J. Bacteriol. 191, 2902–2905 (2009)

4. Boardman B.K., He M., Ouyang Z., Xu H., Pang X., Yang X.F.:

Essential role of the response regulator Rrp2 in the infectious

cycle of Borrelia burgdorferi. Infect. Immun. 76, 3844–3853

(2008)

5. Brossard M., Wikel S.K.: Tick immunobiology. Parasitology,

129, 161–176 (2004)

6. Caimano M.J., Iyer R., Eggers C.H., Gonzalez C., Morton E.A.,

Gilbert M.A., Schwartz I., Radolf J.D.: Analysis of the RpoS

regulon in Borrelia burgdorferi in response to mammalian host

signals provides insight into RpoS function during the enzootic

cycle. Mol. Microbiol. 65, 1193–1217 (2007)

7. Caimano M.J., Kenedy M.R., Kairu T., Desrosiers D.C., Har-

man M., Dunham-Ems S., Akins D.R., Pal U., Radolf J.D.: e

hybrid histidine kinase Hk1 is part of a two-component system

15

that is essential for survival of Borrelia burgdorferi in feeding

Ixodes scapularis ticks. Infect. Immun. 79, 3117–3130 (2011)

8. Casjens S., Fraser C.M. i wsp.: A bacterial genome in ux: the

twelve linear and nine circular extrachromosomal DNAs in an

infectious isolate of the Lyme disease spirochete Borrelia burg-

dorferi. Mol. Microbiol. 35, 490–516 (2000)

9. Cavassani K.A., Aliberti J.C., Dias A.R., Silva J.S., Ferreira B.R.:

Tick saliva inhibits differentiation, maturation and function

of murine bone-marrow-derived dendritic cells. Immunology,

114, 235–245 (2005)

10. Chmielewska-Badora J.: Seroepidemioligic study of Lyme

boreliosis in the Lublin Region. Ann. Agric. Environ. Med. 5,

183–186 (1998)

11. Cisak E., Chmielewska-Badora J., Zwoliński J., Wójcik-Fatla A.,

Polak J., Dutkiewicz J.: Risk of tick-borne bacterial dieseases

among workers of Roztocze National Park (South-Eastern

Poland). Ann. Agric. Environ. Med. 12, 127–132 (2005)

12. Coleman J.L., Gebbia J.A., Piesman J., Degen J.L., Bugge T.H.,

Benach JL.: Plasminogen is required for efficient dissemination

of B. burgdorferi in ticks and for enhancement of spirochetemia

in mice. Cell, 89, 1111–1119 (1997)

13. Couvreur B., Godfroid E. i wsp.: Variability and action mecha-

nism of a family of anticomplement proteins in Ixodes ricinus.

PLoS One, 3, e1400 (2008)

14. Daix V., Vanderplasschen A. i wsp.: Ixodes ticks belonging to

the Ixodes ricinus complex encode a family of anticomplement

proteins. Insect. Mol. Biol. 16, 155–166 (2007)

15. Das S., Banerjee G., DePonte K., Marcantonio N., Kantor F.S.,

Fikrig E.: Salp25D, an Ixodes scapularis antioxidant, is 1 of 14

immunodominant antigens in engorged tick salivary glands.

J. Infect. Dis. 184, 1056–1064 (2001)

16. Derdáková M., Lenčáková D.: Association of genetic variability

within the Borrelia burgdorferi sensu lato with the ecology, epi-

demiology of Lyme borreliosis in Europe. Ann. Agric. Environ.

Med. 12, 165–172 (2005)

17. Dzierzęcka M., Barszcz K.: Borelioza z Lyme u ludzi oraz zwie-

rząt domowych i dziko żyjących. Kosmos, 59, 91–98 (2010)

18. Francischetti I.M., Sa-Nunes A., Mans B. J., Santos I.M., Ribe-

iro J.M.: e role of saliva in tick feeding. Front. Biosci. 14,

2051–2088 (2009)

19. Fraser C.M., Venter J.C. i wsp.: Genomic sequence of a Lyme

disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature, 390, 580–586

(1997)

20. Grewe C., Nuske J.H.: Immunolocalization of a 22 kDa protein

(IPLA7, P22) of Borrelia burgdorferi. FEMS Microbiol. Lett. 138,

215–219 (1996)

21. Grimm D., Tilly K., Byram R., Stewart P.E., Krum J.G.,

Bueschel D.M., Schwan T.G., Policastro P.F., Elias A.F., Rosa

P.A.: Outer-surface protein C of the Lyme disease spirochete:

a protein induced in ticks for infection of mammals. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 101, 3142–3147 (2004)

22. Hyde, J.A., Shaw D.K., Smith R. III, Trzeciakowski J.P., Skare J.T.:

e BosR regulatory protein of Borrelia burgdorferi interfaces

with the RpoS regulatory pathway and modulates both the oxi-

dative stress response and pathogenic properties of the Lyme

disease spirochete. Mol. Microbiol. 74, 1344–1355 (2009)

23. Karna S.L., Sanjuan E., Esteve-Gassent M.D., Miller C.L., Maru-

skova M., Seshu J.: CsrA modulates levels of lipoproteins and key

regulators of gene expression critical for pathogenic mechanisms

of Borrelia burgdorferi. Infect. Immun. 79, 732–744 (2011)

24. Kostick J.L., Szkotnicki L.T., Rogers E.A., Bocci P., Raffaelli N.,

Marconi R.T.: e diguanylate cyclase, Rrp1, regulates critical

steps in the enzootic cycle of the Lyme disease spirochetes. Mol.

Microbiol. 81, 219–231 (2011)

25. Leboulle G., Crippa M., Decrem Y., Mejri N., Brossard M.,

Bollen A., Godfroid E.: Characterization of a novel salivary

immunosuppressive protein from Ixodes ricinus ticks. J. Biol.

Chem. 277, 10083–10089 (2002)

26. Li X., Pal U., Ramamoorthi N., Liu X., Desrosiers D.C., Eggers C.H.,

Anderson J.F., Radolf J.D., Fikrig E.: e Lyme disease agent

Borrelia burgdorferi requires BB0690, a Dps homologue, to per-

sist within ticks. Mol. Microbiol. 63, 694–710 (2007)

27. Lybecker M.C., Abel C.A., Feig A.L., Samuels D.S.: Identification

and function of the RNA chaperone Hfq in the Lyme disease spi-

rochete Borrelia burgdorferi. Mol. Microbiol. 78, 622–635 (2010)

28. Lybecker M.C., Samuels D.S.: Temperature-induced regulation

of RpoS by a small RNA in Borrelia burgdorferi. Mol. Microbiol.

64, 1075–1089 (2007)

29. Narasimhan S., Fikrig E. i wsp.: A tick antioxidant facilitates the

Lyme disease agent’s successful migration from the mammalian

host to the arthropod vector. Cell Host. Microbe. 2, 7–18 (2007)

30. Neelakanta G., Li X., Pal U., Liu X., Beck D. S., DePonte K.,

Fish D., Kantor F.S., Fikrig E.: Outer surface protein B is critical

for Borrelia burgdorferi adherence and survival within Ixodes

ticks. PLoS Pathog. 3, e33 (2007)

31. Nunn M.A., Sharma A., Paesen G.C., Adamson S., Lissina O.,

Willis A.C., Nuttall P.A.: Complement inhibitor of C5 activa-

tion from the so tick Ornithodoros moubata. J. Immunol. 174,

2084–2091 (2005)

32. Pal U., Dai J., Li X., Neelakanta G., Luo P., Kumar M., Wang P.,

Yang X., Anderson J.F., Fikrig E.: A differential role for BB0365

in the persistence of Borrelia burgdorferi in mice and ticks.

J. Infect. Dis. 197, 148–155 (2008)

33. Pal U., Fikrig E. i wsp.: TROSPA, an Ixodes scapularis receptor

for Borrelia burgdorferi. Cell, 119, 457–468 (2004)

34. Pal U., Yang X., Chen M., Bockenstedt L.K., Anderson J.F.,

Flavell R.A., Norgard M.V., Fikrig E.: OspC facilitates Borrelia

burgdorferi invasion of Ixodes scapularis salivary glands. J. Clin.

Invest. 113, 220–230 (2004)

35. Pal U., Fikrig E. (w) Borrelia: Molecular Biology, Host Interac-

tions, and Pathogenesis, red. Samuels D. S., Radolf J. D., Caister

Academic, Norfolk, 279–298 (2010)

36. Piesman J., Schwan T.G. (w) Borrelia: Molecular Biology, Host

Interactions, and Pathogenesis, red. Samuels D.S., Radolf J.D.,

Caister Academic, Norfolk, 251–278 (2010)

37. Radolf J.D., Caimano M.J., Stevenson B., Hu L.T.: Of ticks, mice

and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease

spirochaetes. Nat. Rev. Microbiol. 10, 87–99 (2012)

38. Ramachandra R.N., Wikel S.K.: Modulation of host-immune

responses by ticks (Acari: Ixodidae): effect of salivary gland

extracts on host macrophages and lymphocyte cytokine pro-

duction. J. Med. Entomol. 29, 818–826 (1992)

39. Ramamoorthi N., Fikrig E. i wsp.: e Lyme disease agent

exploits a tick protein to infect the mammalian host. Nature,

436, 573–577 (2005)

40. Rauer S., Wallich R., Neubert U.: Recombinant low-molecular-

-mass proteins pG and LA7 from Borrelia burgdorferi reveal

low diagnostic sensitivity in an enzyme-linked immunosorbent

assay. J. Clin. Microbiol. 39, 2039–2040 (2001)

41. Ren B., Tibbelin G., Kajino T., Asami O., Ladenstein R.: e

multi-layered structure of Dps with a novel di-nuclear ferroxi-

dase center. J. Mol. Biol. 329, 467–477 (2003)

42. Revel A.T., Blevins J.S., Almazán C., Neil L., Kocan K.M., de la

Fuente J., Hagman K.E., Norgard M.V.: bptA (bbe16) is essen-

tial for the persistence of the Lyme disease spirochete, Borrelia

burgdorferi, in its natural tick vector. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

102, 6972–6977 (2005)

43. Samuels D.S.: Gene regulation in Borrelia burgdorferi. Annu.

Rev. Microbiol. 65, 479–499 (2011)

44. Sangamnatdej S., Paesen G.C., Slovak M., Nuttall P.A.: A high

affinity serotonin- and histamine-binding lipocalin from tick

saliva. Insect. Mol. Biol. 11, 79–86 (2002)