BORELIOZA - TESTY- OPIS

BORELIOZA - TESTY- OPIS

Nie ma 100% metody diagnostycznej boreliozy

LymeSpot: Nowa generacja badania EliSpot

Stanowi rozbudowanie metody EliSpot o wykrywanie wydzielania (pod wpływem antygenu) przez komórki układu immunologicznego oprócz interferonu-gamma również IL-2 (interleukiny 2). Substancja ta jest wydzielana przez limfocyty w sytuacji przewlekłego stanu zapalnego oraz procesów autoimmunologicznych. Wynika badania LymeSpot pozwala lekarzowi na różnicowanie między infekcją przez konkretny patogen, a długotrwałym procesem zapalnym. W tym drugim wypadku włączenie antybiotykoterapii nie zawsze jest dobrym rozwiązaniem i właściwym rozwiązaniem. Badanie EliSpot/LymeSpot razem z oznaczeniem stężenia limfocytów CD3 i CD57-NK daje lekarzowi niezwykle potężne narzędzie diagnostyczne w ocenie statusy immunologicznego pacjenta i oszacowania stadium infekcji krętaki Borellia i innymi infekcjami odkleszczowymi

http://borelioza.insieme.com.pl/diagnostyka.html

-------------------------------------------------------------

ELISPOT - test immunoenzymatyczny przyszłości

Test ten ma już ugruntowaną pozycję w wakcynologii, gdzie stosowany jest między innymi w produkcji i testowaniu skuteczności szczepionek przeciw HIV (8-16), wirusowemu zapaleniu wątroby (17), cholerze (18,19), półpaścowi (20), grypie (21,22) czy malarii (23).

Test ELISPOT w kierunku komórek specyficznie reagujących na antygen prątka gruźlicy znalazł już rutynowe zastosowanie kliniczne i cechuje się większą czułością i swoistością w porównaniu do innych dostępnych testów na gruźlicę (24-33).

Technika ELISPOT jest również wykorzystywana w pracach nad skuteczniejszymi szczepionkami przeciwgruźliczymi (34).

Obiecujące są zastosowania testu ELISPOT w wykrywaniu swoistej odpowiedzi immunologicznej na antygeny krętka Borrelia burgdorferi (35,36), krętka bladego (Treponema pallidum) (37) oraz salmonelli (38).

Test ELISPOT stał się niezastąpionym narzędziem w immunologii onkologicznej, gdzie m. in. wyparł radioaktywny test uwalniania chromu w ocenie funkcji komórek cytotoksycznych (39,40). Jest on również szeroko stosowany w badaniach nad szczepionkami przeciwnowotworowymi (41-43).

ELISPOT znajduje ponadto zastosowanie w badaniach naukowych i diagnostyce reumatologicznej, a także w testowaniu leków przeciwreumatycznych (44-55). W diabetologii wykorzystuje się

ELISPOT w wykrywaniu komórek cytotoksycznych skierowanych przeciw wyspom trzustkowym (56).

http://www.radoslawspiewak.net/2007-6p.htm

https://www.alablaboratoria.pl/badanie/9461/test_transformacji_limfocytow_ltt_-_borrelia_met_elispot
---------------------------------------------------------------

W diagnostyce boreliozy stosuje się rozmaite testy diagnostyczne, które można podzielić na 2 grupy:

1) określające odpowiedź naszego układu odpornościowego na zakażenie

2) szukające bakterii wywołującej boreliozę lub jej specyficznych fragmentów czy materiału genetycznego.

Badania układu immunologicznego stosowane w diagnostyce boreliozy dostępne w Polsce:

A/ test Elisa

B/ test Western-Blot  (inna nazwa Immunoblot)

C/ LTTborelioza

Zanim omówię owe testy, krótko o tym jak funkcjonuje nasz układ immunologiczny. Jak do naszego organizmu wtargnie bakteria, to zostaje ona pochłonięta przez centralną komórkę układu odpornościowego zwaną makrofagiem.

Makrofag informuje o bakterii limfocyty B, które zaczynają produkować przeciwciałagłównie IgM i IgG. Najpierw powstają przeciwciała IgM. Ich zadaniem jest otoczyć niczym sieć bakterię,niedopuszczając tym samym do jej dalszej ekspansji.

Ponadto przeciwciała mają „kolce” które w bakterii robią „mikrootworki”. Następnie taka opleciona przez przeciwciała bakteria jest wyłapywana przez komórki żerne, zawierające specjalne enzymy trawienne, wnikające do wnętrza bakterii przez owe „mikrootworki”-i bakteria zostaje strawiona.

Główną rolę w zwalczaniu bakterii odgrywają przeciwciała w klasie IgM-one powstają pierwsze wtedy, kiedy jest czynne zakażenie.

Natomiast przeciwciała w klasie IgG powstają później w okresie zdrowienia, tak na wszelki wypadek, i mogą miesiącami czy nawet latami utrzymywać się we krwi.

Nieco inaczej zachowuje się nasz układ odpornościowy w przypadku zakażenia wirusami.

Po pochłonięciu wirusa przez makrofag poinformowane o tym zostają limfocyty T. Limfocyty T działają na zasadzie strzykawki z trucizną-przyczepiają się do powierzchni wirusa i wstrzykują do jego wnętrza truciznę.

Test Elisa (szuka globalnie przeciwciał)

Najtańszym, ale i najbardziej zawodnym testem jest powszechnie stosowany test Elisa.

W teście tym szukamy np. w surowicy krwi czy płynie mózgowo-rdzeniowym przeciwciał -ale, w przeciwieństwie do znacznie lepszego Western-Blot, identyfikujemy przeciwciała globalnie, czy w ogóle są jakiekolwiek przeciwciała. Przeciwciała bowiem, poza tym że dzielą się na wczesne IgM i późne IgG, mają tzw swoistość. Krętek, każda inna bakteria, zbudowana jest z fragmentów jemu swoistych, tzn występujących wyłącznie u krętka boreliozy, jak i nieswoistych, występujących i u innych podobnych jemu bakterii czy nawet-niekiedy-wirusów.

Podobnie tak jak ludzie-wszyscy mamy np. palce (element nieswoisty) ale różnimy się liniami papilarnymi(element swoisty, wykorzystywany np. w kryminalistyce). Do testu Elisa używamy całego krętka boreliozy-jeśli w badanej surowicy krwi są jakiekolwiek przeciwciała,swoiste lub nieswoiste, to one łączą się z krętkiem boreliozy-takie połączenia zwane kompleksami krętek boreliozy- przeciwciała są oznaczane i wynik jest dodatni.

Niestety jeśli 100 osób jest chorych na boreliozę, to test Elisa wychodzi dodatnio w ok max. 30-40%.Ponadto test Elisa wychodzi dodatnio przy szeregu innych zakażeniach, np. kiłą-czyli daje wiele reakcji krzyżowych.

Wśród naukowców i lekarzy trwają dyskusje na temat możliwości występowania w organizmie chorego z czynną boreliozą wyłącznie przeciwciał IgG. W immunologii, czyli dyscyplinie zajmującej się funkcjonowaniem układu odpornościowego, jest przyjęte, że o czynnym zakażeniu świadczy wzrost zazwyczaj co najmniej 4-krotny miana przeciwciał klasy IgM – to one w pierwszym rzędzie oplatają, otaczają „siecią” komórkę bakteryjną tak, że nie może ona atakować tkanek czy komórek naszego organizmu i może być strawiona przez komórki żerne-zabójcy.

Przeciwciała klasy IgG powstają na wszelki wypadek. IgG długo utrzymują się we krwi w okresie zdrowienia czyli rekonwalescencji, kiedy już nie ma czynnej infekcji czyli zakażenia bakteryjnego.

Z tego kanonu immunologii wyłamuje się borelioza-MOŻE BYĆ CZYNNA BORELIOZA WTEDY, KIEDY SA TYLKO PRZECIWCIAŁA KLASY IgG W SUROWICY KRWI CZY NP.PŁYNIE MÓZGOWO-RDZENIOWYM. Podobnie jest np. w gruźlicy. Dlaczego tak jest, dokładnie nie wiadomo. Nie zawsze również obserwuje się gwałtowny, co najmniej 4-krotny wzrostu miana przeciwciał.

Innym specyficznym, wyjątkowym dla boreliozy zjawiskiem jest tzw. borelioza seronegatywna, czyli taka, w której przeciwciała nie występują w ogóle.

UWAGA-TEST ELISA A TAKŻE WESTERN-BLOT NIE WYKRYJĄ TAKIEJ POSTACI BORELIOZY, W KTÓREJ NIE DOCHODZI DO PRODUKCJI PRZECIWCIAŁ CZYLI TZW. SERONEGATYWNEJ BORELIOZY.

Krótkie podsumowanie testu Elisa:

1. poszukujemy swoistych i nieswoistych przeciwciał(reakcje krzyżowe są bardzo często);

2. do identyfikacji przeciwciał używamy całego krętka boreliozy;

3. test testowi nierówny -są przypadki, że w jednym teście wychodzą przeciwciała np. IgM, a w drugim nie!;

4. zdarza się postać aktywnej boreliozy bez przeciwciał;

5. może być aktywna borelioza zarówno wtedy, kiedy są przeciwciała IgM jak i IgG!

6. w zasadzie nie powinno się wykonywać tego najmniej dokładnego testu! Zdaniem ILADS test ten w ogóle nie powinien być stosowany!

Western-Blot(test szukający swoistych przeciwciał)

Bardzo podobnym do testu Elisa jest test zwany Western-Blot. Idea jego jest bardzo podobna do testu Elisa- szukamy w danym materiale przeciwciał. Ale do tego testu używamy pojedynczych fragmentów„zmielonego i rozkawałkowanego” krętka boreliozy.

Fragmenty te mają oznaczenie np. p41, OspC, Vise i inne i są często określane jako prążki.

Jeśli utworzą się kompleksy fragment krętka boreliozy-przeciwciało,wynik zapisuje się jako dodatni w danym prążku-fragmencie. Dąży się do tego, by używać jak najbardziej swoistych fragmentów-w praktyce nie jest możliwe zastosowanie takiego fragmentu krętka boreliozy, który występuję tylko u niego!

I tak np. fragment p41 występuje u krętka boreliozy i w zakażeniu bakterią Helicobacter pylorii wywołujacej chorobę wrzodową.I tu pojawia się problem interpretacji testu Western-Blot.

Test Western-Blot wychodzi dodatnio w 50-80% i jest testem dość swoistym-powinien być wykonywany w pierwszej kolejności, zawsze w obu klasach.

Interpretacja testu Western-Blot wg ILADS:

Wynik testu Western-Blot może być różnie interpretowany. Jeśli otrzymamy wynik Western-Blot dodatni w jednym prążku np. p41, to najczęściej spotkamy się z opisem: wynik ujemny lub graniczny.

Bo prążek p41 to fragment występujący nie tylko u krętka boreliozy , ale i u kilku innych bakterii np. Helicobacter pylorii.

W praktyce nie odkryto takiego fragmentu krętka boreliozy, który występowałby tylko u niego czyli byłby w 100% swoisty. Co więcej liczne badania pokazują, że im bardziej swoisty prążek , tym wychodzi rzadziej w teście Western-Blot. ILADS stoi na stanowisku, że nie można interpretować testu Western-blot bez odniesienia do objawów klinicznych!

Jeśli ktoś ma dodatni tylko prążek p41 i objawy wskazujące na chorobę wrzodową-należy z dużym prawdopodobieństwem rozpoznać chorobę wrzodową, natomiast przy rozsianych, wielonarządowych i napadowych objawach podejrzewać z dużym prawdopodobieństwem boreliozę.

To tak samo, jakby zrobić poziom cukru we krwi i otrzymać wynik 160mg%-jeśli pomiar wykonywany był na czczo, rozpoznaje się cukrzycę, a ten sam wynikt uznaje się za prawidłowy, jeśli pomiar był wykonany po posiłku. Western-blot podobnie jak test Elisa nie wykryje boreliozy bez przeciwciał czyli seronegatywnej.

Aby wykluczyć boreliozę, test ten powinien być wykonywany co najmniej 5-o krotnie, przed jak i w trakcie testowej antybiotykoterapii.

Zdarza się, że początkowy ujemny test Western-blot staje się dodatni po włączeniu antybiotykoterapii, w tym koniecznie na rozpad cyst!

Krótkie podsumowanie testu Western-blot:

 w badanym materiale , surowicy czy płynie mózgowo-rdzeniowym, są poszukiwane przeciwciała przeciwko-krętkowe;

używamy w miarę swoistych fragmentów krętków(by wyeliminować reakcje krzyżowe);

dodatni wynik testu świadczy o czynnej boreliozie, choć zdania są podzielone czy i w klasie IgG;

w badanej próbce krwi może się zdarzyć, że akurat nie ma oznaczalnych testem W-B przeciwciał– warto więc badanie W-B powtarzać kilkukrotnie i stosować droższe testy zawierające dużo swoistych, znakowanych prążków. Lepiej go wykonać w placówkach naukowych, choć drożej!

Test Western-Blot powinno się wykonywać przed jak i-w przypadku negatywnego wyniku-w trakcie już rozpoczętej antybiotykoterapii i to co najmniej 5-okrotnie!;

zawsze należy wykonywać Western-Blot w obu klasach

Interpretacja testu Western-Blot zawsze powinna być odniesiona do objawów klinicznych wg ILADS!;

test Western-Blot nie wykrywa, podobnie jak test Elisa, seronegatywnej czyli bez przeciwciał postaci boreliozy!

Seronegatywna-bez przeciwciał- borelioza:

przeciwciała pojawiają się z pewnym opóźnieniem od momentu pokąsania przez zarażonego kleszcza. Warto robić testu Elisa czy Western-blot nie wcześniej niż 6 tygodni od momentu kontaktu z zakażonym kleszczem;

we krwi czy płynie mózgowo-rdzeniowym mogą być same kompleksy krętek boreliozy-przeciwciała.

Natomiast test Elisa czy Western-blot wychodzi dodatnio tylko wtedy, kiedy w badanym materiale są same,wolne przeciwciała-testy te nie wykrywają kompleksów.Są badania pokazujące , że np. w płynie mózgowo-rdzeniowym aż w 30-40% w neuroboreliozie występują tylko kompleksy immunologiczne!;

krętek boreliozy może być w formie typowej bakterii( tzn każda bakteria otoczona jest ścianą komórkową)-jeśli w takiej formie, która wg niektórych jest uważana za formę inwazyjną,zostanie pochłonięty przez makrofag, wtedy powstaną wolne przeciwciała.

Jednak w niekorzystnych warunkach krętek boreliozy z typowej formy inwazyjnej bakterii ze ścianą komórkową przemienia się w formę prowirusa(bez ściany komórkowej-a wirusy tym różnia się od bakterii, że m in nie mają ściany komórkowej), o zwolnionym metaboliźmie, „uśpiony” czyli nieinwazyjną, zwaną także niekiedy formą L.

Taka forma L prowirusa szybko otacza się otoczką- pęcherzykiem , z ang. bleps, zaś krętki w formie prowirusa w otoczce-pęcherzyku szybko łączą się ,zlewając się owymi pęcherzykami, tworząc cysty.

Do cysty nie penetrują makrofagi-czyli nasz układ immunologiczny może nie rozpoznać zakażenia krętkami w formie nieinwazyjnej czyli „uśpionego” prowirusa w cystach.

Wiele jest obserwacji lekarzy ILADS,że im dłużej trwa nierozpoznana borelioza, tym częściej jest seronegatywna czyli bez przeciwciał, bo krętki są „uśpione” w cystach;

zdarza się, że krętek w formie prowirusa nie wytworzy pęcherzyka i cysty, ale zostaje w takiej formie pochłonięty przez makrofag. Makrofag wtedy uważa, że jest zakażenie wirusem , a nie bakterią i powoduje powstanie pobudzonych limfocytów T, a nie przeciwciał. Pobudzone limfocyty T skierowane na krętka boreliozy w formie prowirusa wykrywa test zwany LTTborelioza

przeciwciała produkują komórki zwane limfocytami B. Wykazano, że krętek boreliozy może niszczyć te komórki i dlatego może być borelioza bez przeciwciał czyli seronegatywna;

przeciwciała nie powstaną, jeśli ktoś bierze leki immunosupresyjne najczęściej sterydy.

Test LTTborelioza(poszukuje pobudzonych limfocytów T)

Test ten ,opracowany w Niemczech, zdaniem niemieckich naukowców jest bardzo czuły i przydatny zwłaszcza w rozpoznawaniu późnej czy wczesnej rozsianej, ale trwającej kilka tygodni czy miesięcy boreliozy. Warto go na pewno zrobić, kiedy i Western-blot-wychodzi ujemnie. Zdaniem niemieckich naukowców może być on bardzo pomocny także w monitorowaniu skuteczności leczenia boreliozy.

Test ten wykonuje jedynie Synevo(www.synevo.pl)-krew tego samego dnia, co pobranie, jest wysyłana do laboratorium w Berlinie samolotem. Test ten wykrywa seronegatywną czyli bez przeciwciał boreliozę.

Wadą jego jest niestety cena ok 460 zł dla samej boreliozy. Uwaga-jeśli ktoś przyjmuje sterydy, one również powodują zablokowanie powstawania pobudzonych limfocytów T!

Testy szukające żywej lub martwej bakterii lub jej fragmentów:

PCR

Badanie to szuka w badanym materiale np. krwi całych i żywych krętków lub ich materiału genetycznego (pochodzącego z nieżywych, zdezintegrowanych komórek krętka boreliozy).

Dana bakteria, w naszym przypadku krętek boreliozy, dostaje się żywa do krwi (lub płynu stawowego, płynu mózgowo-rdzeniowego) jeśli jest jej bardzo, bardzo dużo . Mówimy wtedy o tzw. krwiopochodnym rozsianiu się bakterii i jej obecności we krwi, co się fachowo określa mianem bakteriemii. Zjawisko to jest bardzo rzadkie. Krętki boreliozy żyją w skórze, mięśniu sercowym, tkance łącznej i nerwowej( piszę o tym powyżej),ale nie np. we krwi.

Co się jednak dzieje, kiedy bakteria zostanie zabita, bądź przez skuteczny antybiotyk lub nasze komórki-zabójcy zwane komórkami żernymi czyli fagocytami?

Antybiotyk czy komórka żerna niszczy bakterię co powoduje jej rozpad na małe fragmenty, które dostają się bądź do wątroby ( i stąd z żółcią do przewodu pokarmowego i są wydalane z kalem), bądź do krwi, a z nią do nerek ( skąd przechodzą do moczu). Wśród tych fragmentów są i takie, które zawierają tzw. materiał genetyczny krętka boreliozy czyli cały zestaw jego genów.

Jeśli w pobranej próbce np. krwi są wszystkie fragmenty z materiałem genetycznym (czyli genami) krętka, to może go wykryć PCR. Oczywiście nie od razu bo jest go bardzo mało. Jak to się robi?

Do takiej próbki krwi dodaje się specjalne enzymy i fragmenty tzw. startery antygenów krętka boreliozy.

Na bazie obecnych we krwi, poszukiwanych, fragmentów krętka boreliozy z jego genami owe enzymy niejako syntetyzują, mając za wzór (matrycę) owe fragmenty krętka boreliozy z genami. Fragment taki namnaża się w laboratorium do poziomu umożliwiającego jego wykrycie (detekcję).

Warunek konieczny – we krwi badanej jako matryca muszą być, choćby pojedyncze, wszystkie antygeny krętkowe! W Poznaniu w Centrum Badań DNA jako starterów używa się fragmentów antygenów krętkowych znakowanych dodatkowo izotopem - jeśli nawet niewiele zostanie zsyntetyzowanych nowych kompletnych genów krętka boreliozy, to i tak łatwo je się wykrywa.

Niestety wiarygodność badania PCR, zwłaszcza wykonywanego w Centrum Badania DNA w Poznaniu, jest podważana w Polsce przez wielu naukowców. Między innymi były robione z tego samego materiału badania PCR w Poznaniu i w innych placówkach i wyniki nie pokrywały się.

Ponadto naukowcy często podają, że PCR Real Time często im wychodził u osób zdrowych. Ja mam pacjentów z PCR Real Time dodatnim, ujemnymi innymi badaniami, dziwnymi objawami klinicznymi, u których poprawa następowała po włączeniu antybiotykoterapii wg zaleceń dra Burrascano i grupy ILADS.

Ponadto osoba bezobjawowa może akurat mieć utajoną boreliozę - krętki mogą być ukryte np. w cyście, do której praktycznie nie wnikają antybiotyki, a cysty nie jest w stanie zniszczyć nasz układ odpornościowy. Do cysty nie potrafią wniknąć komórki żerne - immunologiczni zabójcy.

Antygeny krętkowe w moczu

Jest to znakomity test sprawdzający się, kiedy zawodzą inne testy-jego wadą jest, że często są reakcje krzyżowe i że trzeba przed jego wykonaniem zdecydować się na testowa antybiotykoterapię. Jeśli my weźmiemy coś na rozpad cyst i-obowiązkowo-antybiotyk bakteriobójczy, to wtedy wydostające się z rozpadłych cyst krętki boreliozy są rozbijane przez antybiotyk bakteriobójczy. Fragmenty rozpadłego,nieżywego krętka dostają się do krwi a następnie są filtrowane przez nerki i wydalane z moczem.

Takie fragmenty rozpadłych krętków stąd najłatwiej stwierdzić w porannym moczu. Test ten jest stosunkowo tani.

UWAGA-przed jego wykonaniem nie wystarczy wziąć samego Citroseptu czy antybiotyku na rozpad cyst-trzeba koniecznie dołączyć antybiotyk bakteriobójczy!Test ten wykonuje jedynie w Polsce dr med T.Wielkoszyński (www.wielkoszynski.webity.pl).

W wielu ośrodkach wykonuje się także, po testowej antybiotykoterapii, PCR z moczu-do tego rodzaju badania przymierza się także Centrum Badań DNA w Poznaniu

UWAGA PRAKTYCZNA

Czyli np. mamy dorosłą osobę o wadze 75 kg-jak krok po kroku przeprowadzić w praktyce diagnostykę boreliozy:

1. przed testami należy przez 1 miesiąc wziąć Citrosept 3 x po 15-20 kropli lub lepiej, o ile przepisze lekarz- metronidazol (1 gram/dobę)czy tinidazol(1 gram/dobę).

Cel-rozbicie cyst, wtedy wydostają się do tkanek krętki, mogą być wtedy pochłonięte przez makrofag i dostać się żywe do krwiopochodnym;

2. krok pierwszy-zrobić Western-blot na boreliozę

UWAGA-należy dokładnie przestudiować wynik i przeczytać o zasadach jego interpretacji, jak wyżej;

3. krok drugi-jeśli Western-blot ujemny

Należy wtedy zrobić  panel chorób odkleszczowych.

4. krok trzeci-Western-blot  ujemny

Wtedy trzeba zrobić test LTTborelioza lub-po testowej antybiotykoterapii-antygeny krętkowe w moczu.

Jeśli ktoś bierze sterydy

Nie warto w takim przypadku robić testu Elisa, Western-blot czy LTTborelioza.

Trzeba zrobić PCR albo-po testowej antybiotykoterapii-antygeny krętkowe w moczu.

Można próbować odstawić sterydy na co najmniej 2 miesiące, wziąć coś na rozpad cyst, i dopiero wtedy zrobić Western-blot i/lub LTTborelioza.

UWAGA-JESLI JEST TYPOWY RUMIEŃ WEDRUJACY, NIE TRZEBA ROBIĆ JAKICHKOLWIEK TESTÓW,TYLKO WZIĄĆ ANTYBIOTYK!

Inne metody

Bardzo rzadko (w około 1-2% przypadków) krętki można oglądać w preparacie bezpośrednim barwionym specjalna techniką srebrzenia. Niestety, nie można odróżnić ,czy są to krętki boreliozy czy inne krętki np. kiły.

Czasem udaje się wyhodować krętki boreliozy na specjalnych podłożach, ale tzw. czułość takiej hodowli wynosi 5 do 25 %. Czyli na 100 pacjentów w 100% chorych na boreliozę krętki udaje się wyhodować tylko u 5 do 25 osób. W Polsce prof. S. Tylewska-Wierzbanowska z zespołem z Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie opracowała swoja własna metodę hodowli krętków, mianowicie na żywej hodowli z komórek tkanki łącznej pobranej od myszy. Wg mnie jest to rewelacyjna metoda, ale niestety spotkała się z ostrą krytyką np. polskich naukowców zakaźników. Wielokrotne kontrole nie wykazały jakiś uchybień czy też wyników fałszywie dodatnich. Pani profesor izolowała krętki m. in. u wielu osób ze stwardnieniem rozsianym czy reumatoidalnym zapaleniem stawów. PZH w Warszawie posiada też bardzo czuły test Elisa i wykonuje Western-Blot, ale w przeciwieństwie do np. Instytutu Medycyny Wsi w Lublinie nie wykonuje go u każdego pacjenta, mogącego mieć boreliozę (nawet odpłatnie).

Zmiany w obrazie krwi czyli morfologii czy OB.

Zazwyczaj lekarz podejrzewając jakieś zakażenie zleca m. in. OB, niekiedy tzw. CRP(białko ostrej fazy) oraz morfologię czyli obraz krwinek ze krwi. W zakażeniach bakteryjnych stwierdza się podwyższenie OB, CRP, a w morfologii wzrost tzw. białych krwinek czyli inaczej leukocytów ( z angielskiego WBC, a dokładniej ich podgrupy-neutrofili). Niestety w boreliozie często nie ma odchyleń w tych badaniach, prawdopodobnie dlatego, że krętki szybko przemieniają się w formę zbliżona do wirusa czyli formę L zwaną też prowirusem. W morfologii można niekiedy zaobserwować wzrost limfocytów (obecny często właśnie w infekcjach wirusowych) lub/i monocytów. To samo obserwuje się w innych zakażeniach bakteriami mającymi formę L czyli prowirusa, np. w gruźlicy.

Dr.Piotr Kurkiewicz

http://lymepoland.com/pliki/poradnik-pacjenta.pdf.

------------------------------------------------

TEST ELISPOT

ELISpot, daje niemal stuprocentową skuteczność w wykryciu Boreliozy.Za pomocą ELISpot-u można wykryć pojedynczą komórkę wydzielającą dane białko.ELISPOT dzięki zaawansowanej technologii nie daje żadnego ryzyka zafałszowania badania.

https://www.alablaboratoria.pl/badanie/9461/test_transformacji_limfocytow_ltt_-_borrelia_met_elispot

--------------------------------------------

Diagnozując boreliozę mamy do wyboru wiele różnych testów. Testy, które mają zastosowanie w Polsce opieraja się przede wszystkim na serologii (obecności przeciwciał ) ale trzeba pamiętać, że przeciwciała te nie mogą być związane z antygenem. Kiedy natomiast przeciwciało połączy się z antygenem tworzy tzw. kompleks immunologiczny i nie jest wykrywalne w standardowym badaniu serologicznym (ELISA, czy Western-Blot), jednak dostępne jest w Polsce badanie ilości kompleksów immunologicznych.

Najbardziej popularnym ale też najmniej wiarygodnym jest test ELISA. Nie można go traktować jako tzw. test przesiewowy. Wszelkiego rodzaju defekty immunologiczne, brak wolnych przeciwciał (związane w kompleksach) czy brak produkcji przeciwciał w odpowiedzi na antygeny borrelii dyskwalifikują ten test jako dobry test diagnostyczny. Badanie ELISA dość często daje wynik fałszywie ujemny ale też zdarzają się wyniki fałszywie dodatnie, co dowodzi małej wiarygodności tego testu.

Na obecności przeciwciał opiera się tez test Western-Blot. Na podstawie tego testu oznacza się rodzaj i ilość przeciwciał charakterystycznych dla antygenów boreliozy zwanych inaczej prążkami. W teście Western-Blot ważne jest nie tylko wykazanie charakterystycznych przeciwciał ale też wykazanie ich znamiennej ilości w w obydwu klasach, dlatego test ten powinien być właściwie wystandaryzowany i zinterpretowany.

Znamienne diagnostycznie dla klasy IgG są prążki:18,23,28,30,39,41,45,58,66, 93kDa w liczbie co najmniej pięciu natomiast dla klasy IgM prążki 23,39,41 w liczbie co najmniej dwóch.
Niestety wiele laboratoriów diagnostycznych nie podaje rodzaju i liczby prążków oceniając test jako negatywny czy pozytywny.

Jest to absolutnie naganne bowiem prawidłowo wykonany test Western-Blot musi zawierać w obu klasach rodzaj i liczbę prążków. Dopiero na tej podstawie test można prawidłowo zinterpretować.
W około 20 procentach przypadków test ten może być fałszywie ujemny, tzn. nie wykazać istotnej diagnostycznie liczby i rodzaju prążków przy obecnych charakterystycznych objawach klinicznych.

Dość czułą diagnostycznie metodą jest badanie materiału genetycznego borrelii (PCR). Warunkiem czułości metody jest jednak obecność szukanego materiału genetycznego w płynach ustrojowych (krew, mocz,płyn mózgowo-rdzeniowy). Mając na uwadze, że borelioza to patogen tkankowy test ten nie spełnia kryteriów metody dostatecznie pewnej.

Kolejną metodą istotną w diagnostyce boreliozy jest test LTT. Nie jest on niestety wykonywany w Polsce, ale niektóre laboratoria przesyłaja krew pacjenta do Berlina gdzie badanie to jest wykonywane. Test LTT to test o wysokiej czułości i powtarzalności mający zastosowanie w diagnostyce wielu chorób np.alergia typu IV, dysfunkcje układu immunologicznego, oznaczenie zgodności tkankowej (transplantologia), czy odpowiedz pobudzonych limfocytów T na antygeny borrelii.

Badanie LTT warto wykonać zarówno u pacjentów seropozytywnych (potwierdzenie) jak i seronegatywnych. Ma on też swoje zastosowanie w monitorowaniu terapii 4-6tygodni po zakończeniu leczenia oraz diagnostyce wznowy choroby czy nowego zakażenia.

Dodatni test LTT wskazuje na aktywną chorobe z Lyme. Niestety metoda ta nie jest akceptowana przez niektórych lekarzy zajmujących się boreliozą, gdyż nie jest oficjalnie rekomendowana w polskich standardach diagnostycznych choroby – borelioza.

Test CD57 spełnia ważną rolę w diagnostyce i terapii boreliozy. Wiadome jest, ze aktywna, przewlekła choroba powoduje ubytek subpopulacji limfocytów CD57 (natural killers) stanowiących naturalną linię obrony organizmu człowieka. Badanie to jest stosunkowo niedrogie, wiarygodne i czułe, bowiem tylko zakażenie borrelia powoduje obniżenie odsetka limfocytów CD57.

Rzadziej używane w diagnostyce choroby z lyme są testy: C6 Lyme i badanie obecności antygenów krętkowych w moczu.

Przeprowadzone badania dowodzą dużej przydatności testu C6 Lyme do wykrywania boreliozy z Lyme, nawet podczas gdy testy serologiczne dają wyniki ujemne. Wysoka czułość tego testu sprawia że może być on wykonywany w wcześnie po zakażeniu i jest wiarygodny.

Badanie obecności antygenów krętkowych w moczu (LUAT) jest przydatne gdy testy serologiczne zawodzą, pacjent przyjmuje sterydy, metotrexat czy inne leki immunosupresyjne, pacjent przyjmuje antybiotyki.

Trzeba pamiętać że badanie to jest wiarygodne tylko wtedy kiedy chory jest w trakcie antybiotykoterapii (najlepiej gdy przyjmuje cefalosporynę i tinidazol). Próbki moczu pobiera się drugiego, czwartego i szóstego dnia antybiotykoterapii.

Jeżeli pacjent nie przyjmuje antybiotyków a wymaga wykonania testu LUAT należy wprowadzić antybiotykoterapię prowokacyjną. Test ten bez stymulacji antybiotykami wyjdzie fałszywie ujemny (dr Wielkoszyński), tak więc test LUAT sprawdza się doskonale jako monitorowanie terapii i pomaga podjąć decyzję o jej ewentualnym zakończeniu.

http://www.emg-neurolog.pl/borelioza/
----------------------------------------------------------------
Złożona budowa krętków oraz ich zmienność antygenowa wpływa na konieczność konstruowania i standaryzacji odpowiednio czułych i swoistych testów laboratoryjnych, które wciąż ulegają technologicznym modyfikacjom [11, 25, 27, 30].

Stosowanie dowolnej kombinacji testów ELISA – WB/IB dostarczanych przez różnych producentów oraz brak ujednoliconych kryteriów interpretacji stwarza trudności diagnostyczne i niemożność porównywania wynikówmiędzy laboratoriami [19, 31]. Wykorzystując gatunkowo-swoiste antygeny istnieją wciąż ograniczone możliwości w określaniu specyfiki zakażenia. Diagnostyka z wyboru prowadzona w oparciu o najnowsze testy nie eliminuje całkowicie reakcji krzyżowych. Nadal nie można jednoznacznie wykluczyć zjawiska homologii antygenów różnych genogatunków jak również nie można rozstrzygnąć problemu jedno/wielogenogatunkowej etiologii boreliozy z Lyme [11, 24].

Serologiczna diagnostyka boreliozy w praktyce laboratoryjnej nie jestłatwa, wymaga wiedzy specjalistycznej, wyboru i stosowania wiarygodnych testów, umiejętności interpretacjioraz badań porównawczych nad immunoreaktyw nością surowic w oparciu o najnowsze testy dostępne na rynku.

Bardzo ważna jest wiedza dotycząca pobrania materiału na badanie oraz prowadzenie diagnostyki zgodnie z wytycznymi PTEiLChZ [18–20, 50].

W polskich laboratoriów praktykuje się jeszcze jednostopniowy schemat badania, co potwierdzają dane NIZP-PZH [40].

Diagnostyka boreliozy powinna być prowadzona w laboratoriach, gdzie specjaliści rozumieją ograniczenia poszczególnych testów komercyjnych dostępnych na rynku [1, 13], jak również współpracują z klinicystą w zakresie omówienia wyników i wyjaśniania wątpliwości.

http://www.pm.microbiology.pl/web/archiwum/vol5432015283.pdf.
---------------------------------------------------------

Borelioza - diagnostyka. Testy wykrywające boreliozę

Niestety, żaden z dostępnych testów nie może w 100 proc. wykluczyć ani potwierdzić boreliozy. Badania serologiczne krwi polegają na wykrywaniu przeciwciał IgM i IgG przeciw Borrelii.

Niestety, przeciwciała pojawiają się w surowicy dopiero kilka tygodni po zakażeniu, gdy choroba dawno się rozwija.

W dodatku bakterie mogą się przenosić (z krwi do płynu stawowego lub centralnego układu nerwowego), a wtedy stężenie przeciwciał we krwi spada. Zdarza się więc, że u chorych, mających żywe krętki w organizmie, wynik badania jest ujemny.
W Polsce najpopularniejszy test ELISA – często wychodzi fałszywie ujemnie – jest wiarygodny w 30 proc. przypadków.

Czulszym badaniem (70 proc. wiarygodności) jest test Western Blott, ale można go zrobić po minimum 3 tygodniach od ukąszenia. Najdokładniejszą diagnozę daje PCR, czyli badanie polegające na poszukiwaniu (we krwi lub moczu, płynie stawowym lub mózgowo-rdzeniowym) DNA bakterii. Można je zrobić w kilku miejscach w Polsce już kilka dni po ukąszeniu, nie ma ono bowiem związku z przeciwciałami.

UWAGA. Wynik negatywny któregoś z badań nie wyklucza boreliozy. Najczęściej diagnoza stawiana jest na podstawie objawów klinicznych, po wykluczeniu innych schorzeń. Często borelioza, zwłaszcza przewlekła, jest mylona ze stwardnieniem rozsianym, nerwicą, reumatyzmem, fibromialgią, toczniem rumieniowatym.

Niezawodna diagnostyka sprawiłaby, że niezwłocznie można by leczyć boreliozę. Im wcześniej zacznie się terapię, tym jest krótsza i daje większą szansę na całkowite wyleczenie. Szybko wyleczona choroba nie zostawia szkód w organizmie.

Na razie nie ma co liczyć na szczepionkę przeciw tej chorobie. Gorzej: po przejściu boreliozy nie nabywa się odporności. Pozostaje jedynie chronić się przed kleszczami wszelkimi dostępnymi metodami (ubranie, repelenty).

poradnikzdrowie.pl
-------------------------------------------------------------

http://docplayer.pl/3869118-Dwustopniowa-diagnostyka-serologiczna-boreliozy-weryfikacja-metod.html

-------------------------------------------------------------

Dr.Piotr Kurkiewicz pisze : 

Co robi test LTT?

Wykrywa pobudzone przez makrofaga limfocyty B.Test ten jest tak pomyślany,by te pobudzone limfocyty B produkowały jak najbardziej swoiste przeciwciała-czyli przeciwciała przeciwko takim antygenom bakteryjnym ,które występuja tylko u niej lub u nielicznych innych drobnoustrojów.Jeśli test LTT wykrwywa limfocyty B prokujace przeciwciała p/ciwko antygenowi a25, który jak napisalem moze występować i u 10 innych drobnoustrojów,to jest ten test LTT mniej swosity,niz by wykrywał limfocyty B skierowane przeciwko antygenowi np a35,który wystepuje u tylko naszej bakterii i jeszcze u drugiej.

A to dlatego,ze bakterie,szerzej drobnustroje, to mozajka różnych obcogatunkowych dla naszego organizmu antygenów-nie spotyka się w przyrodzie w zasadzie takiego drobnoustroju z takim antygenem, który wystepowałby tylko w tym jednym drobnoustroju,czyli w 100% swoistym.

Testy Elisa i Western blot wykrywają wolne przeciwciała.
Przy czym Elisa informuje nas,że są w ogóle wolne przeciwciała (te mniej i bardziej swoiste),a Western-Blot ma za zadanie wykryć przeciwciała te bardziej swoiste.

Wolne przeciwciała-czyli takie,które nie oblepiły naszej bakterii i nie wytworzyły tym samym kompleksów!

Wykrywanie kompleksow immunologicznych

Jeżeli w surowicy badanej są tylko same oblepione przeciwciałami bakterie,czyli kompleksy immunologiczne-a zatem nie ma wolnych przeciwciał,czyli Elisa i Western-Blot wychodzą ujemne!Wtedy do takiej badanej surowicy daje sie trucizny np enzymy, które mają za zadanie trawić tylko bakteryjne antygeny, uwalniając przy tym przeciwciała(te trucizny niszą tylko antygeny bakteryjne,nie niszą zaś przeciwciał).

Jak zniszczymy antygeny bakteryjne,to wtedy po prostu powstaną wolne przeciwciała-wtedy robimy test Elisa czy Western_blot

LTT borelioza wykrywa te bardziej swoiste Limfocyty B-wychodzi dodatnio wtedy,kiedy sa albo wolne przeciwciała, albo i komplesky immunologiczne

Wg badań ILADS nie ma testu Elisa w boreliozie,którego czułość i swoistość byłaby ponad 90%.

I tak na jednej z konferencji prezontowano takie doświdczenie-u chyba 25 osób pobrano surowicę i wysłano do 3 różnych referencyjnych laboratioriów reklamowanych przez IDSA(Am Tow Chorób Zakaźnych),w ktorych wykonano Elisa-ja db pamiętam wyniki pokrywały sie z tych 3 laboratoriów tylko w ok 50 %!

---------------------------------------------------------

jak LTT ujemne,wtedy trzeba zrobić LUAT po odpowiedniej prowokacji antybiotykowej.LUAT-antygeny krętkowe w moczu.

-----------------------------------------------------------

W zakażeniach dodatnie testy serologiczne/czyli innymi słowy dodatnie miano przeciwciał/ moga, przy braku objawow, swiadczyc tylko o kontakcie z drobnoustrojem/bylo go mało i poradził sobie z nim nasz ukł odpronosciowy-po tym pozostał tylko slad w postaci dodatniego miana p/ciał/. ALE TEŻ-i to chce podkreslic-w niektorych zakazeniach moze swiadczyć o fazie utajonej owego zakazenia:drobnoustrój jest w naszym organiźmie ,ale nieekspansywyny,nie rozmnazajacy się, czyli nie dajacy objawow.Jednak po jakims czasie-tygodnie miesiace a nawet lata-moze faza utajenia przejść w faze aktywna zakazenia z manifestacja kliniczna;tak jest w gruźlicy i w innych zakazeniach z tzw forma L, czyli-o ile sie takiej formy w boreliozie nie neguje-i w boreliozie.

Stad ja zawsze daje, kiedy dodatnia serologia przy braku objawow w kierunku boreliozy, 2-4 tygodniowa antybiotykoterapie, obserwuje czy nie pojawiaja sie tzw herksy, i pod koniec takiej w pewnym sensie testwej antybiotykoterapii zalecam LUAT/problem w tym,ze w innych odklesczowych chorobach nie ma takiej mozliwości/.Jak np bartonella dodatnia tylko w klasie IgG, nawet mimo brakow objawów, podaje krotko antybiotykoterapie

-------------------------------------------------------------------

Trzeba zrobić KKI, jak KKI ujemne wtedy LTT i LUAT

odpowiedzi dr.Piotra Kurkiewicz ze strony :

http://kleszcze.edu.pl/search.php?st=0&sk=t&sd=d&sr=posts&keywords=LTT+ujemny&t=377&sf=msgonly&ch=-1

----------------------------------------------------------------

Przeciwciała pojawiają się z  opóźnieniem od momentu ugryzienia  przez zarażonego kleszcza.

Test  Elisa lub  Western-blot robic trzeba po około  6 tygodniach  od momentu ugryzienia:

Jeśli krętek boreliozy jest  w formie typowej bakterii (tzn. każda bakteria otoczona jest ścianą komórkową) - nasz organizm widzi bakterie i wytwarza przeciwciała.

Jednak w pewnych warunkach krętek boreliozy z typowej formy bakterii ze ścianą komórkową przemienia się w formę prowirusa (bez ściany komórkowej-a wirusy tym różnią się od bakterii, że m.in. nie mają ściany komórkowej), o zwolnionym metabolizmie,jest w  „uspieniu” czyli jest nieinwazyjną forma zwaną także formą L.

Forma L szybko otacza się otoczką - pęcherzykiem, z ang. bleps, zaś krętki w formie prowirusa w otoczce-pęcherzyku szybko łączą się, zlewając się owymi pęcherzykami, tworząc cysty.

Żaden Western-Blot ponadto nie wykryje kompleksów immunologicznych

Do cysty nie penetrują makrofagi - czyli nasz układ immunologiczny może nie rozpoznać zakażenia.

Test o nazwie KKT wykrywa kompleksy immunologiczne.

Przeciwciała nie powstaną, jeśli ktoś bierze leki immunosupresyjne najczęściej sterydy.

Lekarze ILADS uwazaja że im dłużej trwa nierozpoznana borelioza, tym częściej jest seronegatywna czyli organizm NIE wytwarza  przeciwciał, bo krętki są schowane  w cystach.

Jest możliwe  że krętek w formie L nie wytworzy pęcherzyka i cysty, ale zostaje w takiej formie pochłonięty przez makrofag.

Makrofag wtedy zauwaza zakażenie  bakterią i powoduje powstanie pobudzonych limfocytów B które produkują przeciwciała.

Obudzone limfocyty B produkujace przeciwciała  skierowane sa na krętka boreliozy  wykrywa je test zwany LTT - na Borrelia.  LTT borelioza wychodzi dodatnio nawet wtedy, kiedy są same kompleksy immunologiczne. 

----------------------------------------------------------------

PROBLEMY z DIAGNOSTYKA

http://www.lymepoland.com/borelioza

-------------------------------------------

Rozpoznanie ( oficjalne stanowisko lekarzy IDSA )

Ze względu na obecność objawów niespecyficznych, nakładanie się na siebie stadiów i postaci choroby oraz wciąż niedoskonałe laboratoryjne metody diagnostyczne rozpoznanie boreliozy z Lyme należy opierać na bardzo dokładnie zebranym wywiadzie (historia pokłucia przez kleszcze, choroby towarzyszące, zażywane leki), stwierdzeniu objawów klinicznych odpowiadających postaci/postaciom choroby według obowiązujących w Polsce zaleceń Polskiego Towarzystwa Epidemiologów i Lekarzy Chorób Zakaźnych (PTEiLChZ) oraz prawidłowej interpretacji wyników uznanych badań laboratoryjnych (tab.1 i 2) [1, 7, 8].

Optymalną metodą diagnostyczną boreliozy z Lyme byłaby hodowla B. burgdorferi z materiału biologicznego pochodzącego od pacjenta. Niestety, liczba krętków jest w nim za mała, poza tym bakteria wymaga do wzrostu bardzo bogatego podłoża płynnego, ponadto czas między podziałami komórkowymi jest bardzo długi (ok. 12 godzin) [8]. Nawet jeżeli jakieś laboratorium podjęłoby się takiej hodowli, to trzeba się liczyć z tym, że czułość tej metody jest bardzo różna i waha się od ok. 1% w boreliozie stawowej do 70% w rumieniu wędrującym [9].

Zatem podstawą laboratoryjnej diagnostyki boreliozy z Lyme (z wyjątkiem EM) są badania serologiczne wykonywane dwustopniowo, w ściśle określonej kolejności (patrz tab. 3). Najpierw poszukuje się w surowicy chorego swoistych przeciwciał klasy IgM i/lub IgG metodą immunoenzymatyczną (testy ELISA, najlepiej III generacji). Stosowane testy odznaczają się bardzo wysoką czułością, ale mimo wprowadzania do nich coraz doskonalszych antygenów rekombinowanych B. burgdoferi wciąż stwierdza się pewną liczbę reakcji krzyżowych, co może skutkować wynikami fałszywie dodatnimi, np. w infekcyjnym zapaleniu wsierdzia, reumatoidalnym zapaleniu stawów, w innych krętkowicach (kiła), mononukleozie zakaźnej oraz w różnych chorobach autoimmunologicznych. W związku z tym w drugiej części badania wyniki dodatnie lub wątpliwe (nie ujemne!) są weryfikowane za pomocą testów o wysokiej swoistości dla krętków B. burgdorferi metodą Western blot [3, 7, 8, 9, 10].

Swoiste przeciwciała w klasie IgM pojawiają się we krwi po upływie 3–4 ty-godni od zakażenia, szczyt osiągają od szóstego do ósmego tygodnia, a zanikają zwykle w ciągu 4–6 miesięcy. Często jednak utrzymują się nawet przez kilka lat (również po leczeniu antybiotykami), więc nie mogą być używane do diagnostyki w późnej fazie boreliozy (nie rozstrzygają o czynnym procesie chorobowym i nie są wskazaniem do leczenia).

Natomiast swoiste IgG są wykrywane w surowicy krwi po upływie 6–8 tygodni od zakażenia i mogą występować w wysokich mianach wiele lat po skutecznej antybiotykoterapii. Serokonwersja z IgM do IgG następuje zwykle po dwóch tygodniach od zakażenia. Dodatnie wyniki badań serologicznych w kierunku boreliozy z Lyme (zwłaszcza utrzymujące się latami izolowane przeciwciała w klasie IgM) bez objawów klinicznych charakterystycznych dla tej choroby nie mogą być podstawą do rozpoznania i zastosowania antybiotykoterapii [1, 3, 7].

Do diagnostyki neuroboreliozy służy również płyn mózgowo-rdzeniowy. Ocenia się w nim pleocytozę, poziom białka i glukozy. Charakterystyczne zmiany często można stwierdzić w zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych, ale bardzo rzadko w innych postaciach NB. Stosuje się również badania na obecność swoistych przeciwciał IgM i IgG, ale żeby wykluczyć ich bierne przenikanie przez barierę krew – mózg, należy potwierdzić ich wewnątrzoponowe wytwarzanie. Badanie płynu stawowego daje wynik nieswoisty i nie jest rutynowo stosowany w diagnostyce boreliozy stawowej. Natomiast w postaciach skórnych boreliozy z Lyme zaleca się dodatkowo przeprowadzenie badań histopatologicznych wycinków zmian skórnych [1, 3, 7, 9].

Należy pamiętać, że metoda PCR, która może służyć do wykrywania DNA krętków B. burgdorferi, nadal nie jest wystandaryzowana i nie nadaje się do stosowania w rutynowej diagnostyce boreliozy z Lyme. W wyjątkowych sytuacjach (wątpliwe przypadki postaci skórnych, wczesne postacie neuroboreliozy lub postaci stawowej, jeśli badania immunoserologiczne krwi są jeszcze ujemne) jest dopuszczalne zastosowanie tej metody w badaniu wycinka skóry, płynu mózgowo-rdzeniowego lub płynu stawowego [3, 7, 8, 11].

Nowe metody diagnostyczne, to jest: testy transformacji limfocytów (LTT), ocena subpopulacji limfocytów CD57+/CD3, poszukiwanie cyst, oznaczanie poziomu przeciwciał w krążących kompleksach immunologicznych, a nawet badanie kleszcza usuniętego ze skóry pacjenta (poszukiwanie materiału genetycznego krętka B. burgdorferi), nie mogą być rutynowo stosowane, gdyż nie potwierdzono ich wiarygodności w diagnostyce boreliozy z Lyme [3, 7, 10].

http://www.zakazenia.org.pl/index.php?okno=7&id=1382&art_type=14

-----------------------------------------------------------------------
 MICROSCOPY

This is the examination of a blood smear or tissue sample using a high definition microscope to directly detect the presence of spirochetes. This is a lengthy and insensitive technique when used on blood because of the low numbers of Borrelia present, especially in the very early stage of infection. Additionally, very few clinical trials using this technique have been reported, making it difficult to ascertain the usefulness of this method in the analysis of those with very early infection or in a relapsing period of disease. Also, other spirochetal diseases would need to be excluded when relying on this method.
Focus floating microscopy has been developed for detecting spirochetes in tissue samples but this has not been used outside the research laboratory and has the practical difficulty that potentially infected tissues must be identified and biopsied.

CULTURE DETECTION

Because Borrelia have a fastidious growth requirements, these organisms are difficult to culture, and even under optimal conditions, their growth is very slow. Accordingly, culturing the bacteria, as in the diagnostic tool is not practical for Lyme disease, specifically for two reasons: first, Borrelia have evolved to propagate in a living host, therefore, culturing them is fraught with difficulties and these methods are often not reproducible with clinical rigor; and second, because they grow so slowly, results cannot be reported in a reasonable period of time.

BIOPSY

Approximately 60-80% of specimens isolated from the leading edge of a suspected erythema migrans lesion by means of saline-lavage needle aspiration or 2-mm punch biopsy reveal B. burgdorferi. However, because the presence of a lesion in combination with a confirmatory history and clinical presentation are sufficient to initiate treatment, these skin biopsy procedures are seldom performed.

SEROLOGY

The human immune system produces specific antibodies in response to foreign substance present in the body. Therefore, antibody-based tests identify these specific antibodies that are produced in response to a bacterial infection. Blood tests that identify antibodies specific to the bacteria B. burgdorferi are among the most commonly used diagnostics for Lyme disease. This method of diagnosis is referred to as serology. If the antibody-mediated immune response has not developed sufficiently, it is possible for these tests to yield negative results, despite an active infection. Conversely, antibodies can persist for years after treatment, therefore, in the absence of an active infection, asymptomatic patients may produce a positive serology result.
Lab tests detect two different classes of antibody, IgM and IgG.

• Borrelia IgM (immunoglobulin M) antibodies are usually detectable in the blood about two to three weeks after exposure. IgM levels increase to maximum concentrations at about six weeks and then begin to decline.
• Borrelia IgG (immunoglobulin G) antibodies are not detectable until several weeks after exposure, increase to maximum levels at about four to six months, and may remain at high levels for several years.

Of note, B. burgdorferi, through gene recombination, can modify its surface antigens, creating different outer surface antigens, helping to avoid immune recognition leading to false negative test results.
The two most commonly used antibody-based tests are the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the Western blot (immunoblot).
During the first four-to-six weeks of Lyme infection, these tests are often unreliable because most patients have not yet developed a sufficient antibody response for the test to detect. Even later in the illness, the two-tiered testing is highly insensitive missing roughly half of those who have Lyme disease.
In two-tiered Lyme disease testing the first tier is a screening test (i.e. ELISA), which would optimally identify anyone who might have the disease. Screening tests are typically designed to largely identify all infected individuals and are regarded as having high sensitivity. However, these tests often produce false positives. For this reason, this test is followed by a second confirmatory test (i.e. immunoblot) that is intended to make sure that only people with the disease are diagnosed. Tests that do this well have high specificity.
In Lyme disease, the second test (i.e. Western blot) is highly specific, assuming that antibodies have been produced as a result of the infection. So there are very few false positives. Unfortunately, the screening test for Lyme is highly insensitive and fails to accurately identify all patients who have Lyme disease. For this reason, the standard two-tiered Lyme test misses roughly 54% of infected patients (Stricker & Johnson 2010).
Serology is currently the most commonly used diagnostic method for Lyme disease. A positive serology test only suggests the patient has been exposed to the pathogen and is not diagnostic of an active infection. Utilizing an ELISA as a screening tool, followed, if positive, by a confirmatory

Western blot, is not an adequate approach. The ELISA is not sensitive enough to serve as an adequate screen, and there are many patients with Lyme who test negative by ELISA yet have fully diagnostic Western blots. ELISA is the simplest, least expensive, easiest to perform, and most common Lyme test ordered. The typical Lyme test is based upon the detection of serum antibodies made in response to Borrelia burgdorferi exposure. It is a preferred test by laboratories, not because it is more accurate than other Lyme tests, but because can be easily automated. Therefore, many different patient samples can be performed by a single machine simultaneously. This allows for a faster turnover, less costs, and theoretically, standardized test results that are consistent from lab to lab. The ELISA test sounds simple and straightforward, but it has some major flaws. Borrelia species are some of the most polymorphic bacteria known to exist. In other words, most Borrelia can significantly change their surface proteins enough during cell division as to evade our immune system, and may differ from laboratory strains enough to result in negative tests, even if antibodies are present! Tom Grier (microbiologist and also former Lyme patient) wrote many reviews on Lyme-related tests. He presents a very compelling analysis as to why ELISA tests are imprecise: “The ELISA test depends on the active, free antibodies to attach to the free antigens that have been embedded on the walls of the test tube. If the antibodies in the serum being tested are already attached to antigens, then the enzyme reaction cannot take place. If we think of antibodies as sort of keys that fit into locks, and that on the surface of the bacteria are specific locks we now call antigens, you can see that once a key is inserted into a lock, the key is no longer available to open any other locks. What makes this test so misleading is that many doctors accept high readings as an indication that the patient must really be sick. This logic is exactly backwards. If a patient is really infected with lots of bacteria, that means they have a lot of bacterial antigens floating around in the blood that are complexing free antibodies. So, as free antigen increases, free antibody decreases. Since the ELISA test detects only free antibody, a negative test might actually indicate a more serious infection. Many times, I have seen totally asymptotic patients with ELISA titers over 1000 be treated as though they were on death’s doorstep simply because they had a high titer, while patients with borderline titers who are practically disabled are ignored, because a low titer is perceived as meaning less infected! These conclusions are erroneous and actually opposite to the truth, which is that a high titer means greater natural immunity.”
The Western Blot is specific because it provides a detailed map of the different antibodies the immune system produces to the bacteria. The map separates the antibodies by the weight of their respective antigens (bacterial proteins) and is reported in units called kilodaltons or kDa. For example, a Western blot may report bands at 22-, 23-, 25-, 31-, 34-, 39-, and 41- kDa. Each of these bands represents an antibody response to a specific protein found on the spirochete. The 41-kDa band indicates an antibody to the 41-kDa flagella protein and is nonspecific with respect to the bacterial species. The 31-kDa band represents the OSPA protein and is specific for just a few species of Borrelia, as is the 34-kDa OSPB band, and 23-kDa OSPC band.
Western blots are reported by showing which bands are reactive. 41-kDa band appear the earliest in the course of the disease but can cross react with other spirochetes. The 18-kDa, 23 to 25-kDa (Osp C), 31-kDa (Osp A), 34-kDa (Osp B), 37-kDa, 39-kDa, 83-kDa and the 93-kDa bands are the species-specific ones, but appear later or may not appear at all. You should see at least the 41-kDa and one of the specific bands. The 55-kDa, 60-kDa, 66-kDa, and 73-kDa are nonspecific and nondiagnostic. Different brands of Borrelia immunoblot are readily available. The kit from Mikrogen detects antibodies against four immunopathogenic genospecies (B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzelii, B. spielmanii and B. bavariensis) on one single test strip:
–          VlsE from different genospecies
–          OspC from all genospecies
–          p18 (Decorin binding protein A = DbpA) from all genospecies
The advantages of using this method, assuming the patient develops an antibody response, are high sensitivity and specificity, easy and clear interpretation due to easy to read bands, optimum presentation without cross-reacting Borrelia proteins, immunodominant antigens of the four genospecies: B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzelii, B. spielmanii and B. bavariensis, separate detection of IgG and IgM antibodies, and safe evaluation due to strip specific controls (cut-off and conjugate control). Thus, in the case where the patient was able to develop antibodies, this test will most optimally reveal their presence. However, in the case where the patient did not produce antibodies, this test will remain negative despite the infection. In order to ensure the most specific bands are included in the immunoblot, ask the Laboratory to inform on the antigens included in the test and to provide the full report, not only the final result (positive/borderline/negative).
Special attention is granted to B. miyamotoi, which usually does not cross react with B. burgdorferi tests (Branda & Rosenberg 2013; Lee et al. 2014). B. miyamotoi might be detected by PCR or by EliSpot.

Lastly, a new serology test for Lyme disease, called SeraSpot, has been heavily marketed. It is very similar to the Western blot but lends itself well to automatization and, therefore, high-throughput thus enabling quicker assessment in the clinical laboratory. Seen that both approaches enable quantification, there is no real improvement in serology-based testing with SeraSpot when comparing to it Western blot, providing that the Western blot contains very specific antigens, such as the Mikrogen kit, used in several laboratories or the diagnostic from IgeneX.
A major problem with Lyme diagnostics is that no single blood test provides definitive results. Two of the most commonly used tests, ELISA and Western blot, both rely on the presence of serum antibodies produced against B. burgdorferi. Unfortunately, the results of these tests can be inaccurate, and analysis methods are not always consistent from laboratory to laboratory. The ELISA test can produce a false negative if performed too soon, and a Western blot should always be performed to confirm positive ELISA result. Both tests indirectly detect infection by reacting with antibodies in the blood serum; however, the presence of antibodies doesn’t always mean an active infection is present, but it does indicate exposure to the infectious agent. Conversely, the absence of antibodies cannot definitively confirm the absence of infection.
As a final note, Lyme bacteria can attach themselves to proteins, thereby masking the proteins previously recognized by antibodies. They also have the capacity to enter cells, including cells of the nervous system and immune system. Once inside of a cell, they are no longer accessible for antibody binding. It is important to know that Borreliosis is an immunosuppressive disease, which may prevent antibody production. So while a Western blot may be very specific in detecting Lyme-specific antibodies, neither it nor an ELISA tests is useful once the body has ceased creating antibodies.

C6 ELISA TEST

C6 is a synthetic peptide (C6 Peptide) derived from the VIsE protein, which appears in early as well as late stage Lyme disease. The assay identifies the presence of antibodies against this synthetic peptide. However, its sensitivity is reported to be only 70-74%, thus lower than that of a complete Western blot inclusive of highly specific antigens (23, 31, 34, 39, 83-93 -kDa bands); therefore, it is prudent to perform a confirmatory Western blot.  In light of this, it is more efficient and less costly to only perform a Western blot. Furthermore, Embers et al. (PLoS One 2012) demonstrated that the C6 peptide antibody test is unable to detect persistent infection, even when other methods confirm bacterial presence in the tissues of infected monkeys. Thus, the C6 peptide antibody test was shown to be an unreliable diagnostic tool in treated and untreated monkeys, given that a positive result can become negative.

CD57 CELLS COUNT

In chronic Lyme Borreliosis, the CD57 count is both useful and important. CD57+/CD3- cells are a subset of natural killer (NK) cells. NK cells play a crucial function in innate immunity, recognizing and killing virus-infected cells and tumor cells. Dr. Stricker and collaborators (Stricker & Winger 2001; Stricker et al. 2002) reported that the number of CD57+/CD3- cells was decreased in chronic (not acute) Lyme disease. Although acute infections can be treated with antibiotics, failure to treat may result in a chronic, debilitating illness characterized by musculoskeletal and neurologic symptoms. Chronic Lyme disease may be difficult to treat, but also to diagnose (Aguero-Rosenfeld et al. 2005).
The number of CD57+/CD3- cells is decreased in chronic Lyme disease patients, particularly those with pronounced neurologic symptoms. Patients with low CD57 have significantly more co-infections and persistent immunologic defects than patients with higher counts. In patients that respond to antibiotic therapy, the number will come back to normal following treatment, but in patients with persistent Lyme disease, CD57 levels remain low. The assay is a three-color flow-cytometry-based assay. Whole blood is stained with antibodies directed against the CD3 and the CD57 antigens; the absolute number of CD57-positive/ CD3-negative lymphocytes (cells per μl of whole blood) is determined by flow-cytometry. Result indicates the absolute number of CD57+/CD3- cells (cells/μl). The normal range is 60-360 cells/μl. Untreated, chronic Lyme disease patients have values below 60.
Of note, low CD57 count was also evidenced in autistic children (Siniscalco et al. 2016). This might also point to the importance of multiple infections in autism-spectrum disorders.

LYMPHOCYTE TRANSFORMATION TESTS

The Lymphocyte Transformation Test (LTT) was originally developed in the 1960s for evaluating histocompatible class II HLA antigens. The method was then modified for class II antigen typing and also applied extensively to detecting type IV allergies to drugs, metabolites, infectious organisms and metals. LTT became a common test for detection of allergy to beryllium, nickel, gold, cobalt, chromium and palladium.
These tests are specific for actual antigens, not antibodies, and are considered more accurate in Lyme diagnosis, particularly with regards to an active ongoing infection

1. MELISA LTT

In 1994, Stejskal and colleagues published a modification of the LTT for detecting metal sensitivity – the MELISA test. The MELISA technology is now applied to diagnose active Lyme disease (Valentine-Thon et al. 2006).
A positive reaction in the MELISA test demonstrates current active infection with Borrelia burgdorferi sensu lato. In addition to the standard four recombinant antigens derived from B. afzelii and B. garinii, the test usually includes three additional antigens derived from B. burgdorferi sensu stricto (a recombinant outer surface protein OspC, a recombinant p41-internal fragment, and a full antigen lysate). MELISA is a lymphocyte transformation test, which detects not antibodies but cellular immunoreactivity characteristic of active infections of Borrelia burgdorferi. The test improves laboratory diagnosis by confirming active disease in patients with clinical symptoms of Lyme. This test is based on use of peripheral blood mononuclear cells, incubated together with controls, in a multi-well culture plate coated with recombinant Borrelia antigens at three dilutions for five days at 37 °C with 5% carbon dioxide atmosphere.  If the lymphocytes have previously encountered the antigen, the cells will divide and this division is measured through the uptake of radioactive methyl-3H-thymidine. The LTT-MELISA can measure disease activity in those infected patients who have not mounted an adequate antibody response, however, it is advisable to perform Western blot in parallel given that some Western blot-positive patients were tested negative by LTT-MELISA (Puri et al. 2014).

2. ELISPOT AND LYMESPOT REVISED

The EliSpot (Enzyme-linked Immunosorbent Spot Assay) measures the number of activated T-lymphocytes in cell cultures based on their release of cytokines upon being challenged by a reactive antigen. Presently, only a few publications are available to date and their conclusions are divergent (Forsberg et al. 1995; Nordberg et al. 2012; Jin et al. 2013).
The EliSpot (Interferon γ-test) is a test to detect an infection with Borrelia and various co-pathogens on a cellular level.
While the existing EliSpot test is exclusively based on the production of interferon-γ, the new LymeSpot test also evaluates the production of the cytokine interleukin (IL)-2. If the ratio of interferon-γ IL-2 is reversed, a latent disease can be assumed.
More and more laboratories perform LTT tests for Borrelia and some co-infectants. But, as for Western blot, it is very important to know which antigens are used in the test. Ask for a list of the antigens used and check for their specificity and the list of species covered. Not all laboratories use multiple antigens.

PCR tests

Targeting DNA using polymerase chain reaction (PCR) may be useful since it is a direct measurement of the pathogen and not based on indirect serology.
PCR is a blood test that amplifies a key portion of DNA from the Lyme bacteria so that it can be detected. While PCR is highly accurate when the Lyme DNA is detected, it produces many false negatives. This is because the Lyme bacteria are sparse and may not be in the sample tested. Instead of identifying antibodies to the Borrelia bacterium, the PCR is a direct measurement of the organism itself. Unfortunately, PCR testing commonly produces false negatives because Lyme bacteria tend to only reside in the blood for short periods of time, preferring to dwell in tissues with reduced vascular circulation.
PCR is a specific and sensitive method for rapid and direct detection of B. burgdorferi. It has shown utility for detection of Borrelia DNA from skin biopsies of ECM lesions, as well as DNA from synovial and cerebrospinal fluid in late-stage of the disease. Borrelia DNA can also be detected from blood but PCR results should be correlated with clinical presentation of the patient. Due to the clinical sensitivity limitations of the PCR assay, a negative result does not preclude the presence of the organism or active Lyme disease. Also, a negative result does not rule-out Lyme disease, since inhibitory substances may be present in the specimen. Through proper design of degenerate PCR primers, multiple species can be detected in a single test or, conversely, primers can be designed to identify a specific species. PCR test results should be used as an aid in diagnosis and not as a stand-alone diagnostic. These results should be correlated with clinical presentation of the patient. Concurrent infections with multiple tick-borne pathogens, including Bartonella, Ehrlichia chaffeensis/Anaplasma phagocytophilum and Babesia microti have been reported, and consideration should be given to testing for other pathogens if clinically indicated.
Although PCR is an inherently sensitive and specific method, results are frequently negative in spite of the patient having an infection. This is typically a consequence of a lack of bacteria in the assayed sample. Blood may be negative for Lyme DNA because when Borrelia is present in the tissue in cyst-form, it rarely releases any genetic material into circulation. Also, individuals with Lyme disease frequently have periods of time when they are symptomatic and then asymptomatic, which is reflective of the bacteria’s activities. The PCR test can come back positive or negative depending on the activity level of the infection. In later stages of the disease, it is more likely that bacteria will move to tissues thus testing blood samples will give negative results.

ANTIGEN DETECTION TESTS

Antigen detection tests look for a unique Lyme protein in fluid (e.g. blood, urine, synovial fluid). Sometimes people whose indirect tests are negative are positive on this test.
Recently, the Nanotrap^® LA Test was received national notoriety when a 1 million USD grant was awarded by Bill and Melinda Gates Foundation. This test uses the Nanotrap® technology to directly measure Lyme antigens in urine using a Western blot format. The Nanotrap^® test is designed to provide high sensitivity and accuracy, delivering confident results at the earliest stages of infection. The Nanotrap^® LA test uses a direct approach identifying a Lyme bacterial antigen, which is present in the body and can be detected within days of initial infection. Conversely, the Nanotrap^® LA Test will provide a negative result indicating no presence of the antigen if the infection has been eliminated with effective treatment.

ENERGETIC TESTS

There is no one “gold standard” test for all Lyme disease infections that is 100% accurate. For this reason, many Lyme-literate doctors diagnose Borrelia and co-infections based upon symptoms, lab tests and unconventional, but sometimes more sophisticated types of alternative testing, such as energetic testing.
Electrodermal screening devices (such as the ZYTO or ASYRA), for instance, use a software program and the body’s galvanic skin response to detect energetic imbalances in the body. They can also be used to detect the energetic frequencies of a wide variety of pathogenic microbes, and therefore, the presence of those microbes. A software program connected to a hand cradle or other device scans the body for infections and other imbalances and then displays a report of the different pathogenic organisms that are suspected to be in the body, and at what levels. Many Lyme-literate practitioners, such as Lee Cowden, consider the ZYTO to be over 90% accurate. Other devices may be more or less accurate.
Applied Kinesiology, or muscle strength testing methods, such as Autonomic Response Testing (ART), which was developed by Lyme-literate physician Dietrich Klinghardt, are another way to test the body for infections using the energy of the human body and the autonomic nervous system. Applied Kinesiology can be very useful for helping to establish a diagnosis.
For ART and some other common muscle testing methods, the practitioner applies strength to one of the patient’s muscles (usually the arm), while holding a substance (in this case the energetic signature of, or physical substance of a pathogen) against the patient’s body. He or she will then ask the patient to resist. The autonomic nervous system will respond to that substance or pathogen by creating either a strong or weak muscle response in the arm of the person being tested, thereby indicating to the practitioner whether the pathogen is in the body. However, accurate results depend largely upon the skill and experience of the practitioner.

TESTING FOR CO-INFECTIONS

In Lyme disease concurrent infections frequently occur. The clinical and pathological impact of co-infections were first recognized in the 1990s (Mitchell and al. 1996). Their pathological synergism can exacerbate Lyme disease or induce similar disease manifestations. Co-infecting agents can be transmitted together with Borrelia burgdorferi by tick bite resulting in multiple infections but a fraction of co-infections occur independently of tick bite. Infections caused by these pathogens in patients not infected by Borrelia burgdorferi can result in clinical symptoms similar to those occurring in Lyme disease. This applies particularly to infections caused by Bartonella henselae, Yersinia enterocolitica, and Mycoplasma pneumoniae. Chlamydia trachomatis primarily causes polyarthritis. Chlamydophila pneumoniae not only causes arthritis but also affects the nervous system and the heart, which renders the differential diagnosis difficult. The diagnosis is even more complex when co-infections occur in association with Lyme disease (Berghoff 2012).
Concerning their testing options, they are quite similar to the tests for Lyme borreliosis. PCR, ELISA and/or immunofluorescence diagnostics are available for most of them but they do not cover all species. Also, they all need to be combined with clinical presentation.

-Babesia – FISH (fluorescence in situ hybridization – most specific and most sensitive), Giemsa smear, Immunofluorescence (IFA), Serology, PCR.

-Bartonella –For Bartonella there is only serology testing for B. henselae and B. quintana and there is no Western blot available. Bartonella is very difficult to uncover in that multiple species are known (over 30) and frequently organized in biofilms (containing cells and extracellular polymeric substance, thus creating a matrix that provides a physical barrier for testing and treatment). Among available diagnostics, there are also IFA (quite unreliable), PCR (need for multiple sets and usually fail in the case of biofilms), blood smear, rarely: culture + PCR tests. As an indirect option, vascular endothelial growth factor (VEGF) testing is often useful in that Bartonellosis is accompanied by a stimulation of blood vessel formation, inducing granulomas in various regions of the skin (Kempf et al. 2001). VEGF levels will rise in presence of Bartonella infection but only if mold infections are absent.  If present, characteristic Bartonella skin rash is of great diagnostic value.

–Brucella – BrucellaCAPT, agglutinating antibodies, PCR.
–Ehrlichia / Anaplasma – ELISA, EliSpot, PCR, Giemsa smear.
–Rickettsia – PCRs, serology/IFA testing.
–Coxiella – PCRs, IFA testing
–Tularemia (Francisella tularensis) – antigen detection assays, ELISA, PCR, culture, direct fluorescent antibody.
–Leptospira – serology, immunochromatography.
–Leishmania – serology.
–Mycoplasma – serology (ELISA), PCRs (on blood, sputum, swaps), bacterial culture
–Chlamydias –Western blot, ELISA, PCR, EliSpot.
–Yersinia – Western blot (Y. enterocolitica and Y. pseudopneumoniae), EliSpot, antigen testing in stool (Y. enterocolitica only).
Of note, an immune-mediated response to Yersinia antigens may play an important role in the pathogenesis of chronic undifferentiated arthritis and in chronic inflammation (van der Heijden et al., 1997; Saebo & Lassen 1994).
–Epstein-Barr Virus (EBV) – Western blot, PCR, EliSpot, serology, antigen test.
–Cytomegalovirus (CMV) – Western blot, PCR, EliSpot, serology, antigen test.
–Coxackie virus – PCRs, antigen test, serology.
–Herpesviruses – serology, PCRs.

The list of possible co-infectants is not exhaustive. New pathogens are frequently evidenced, as well as opportunistic infections. Also, new investigational testing is in development and hopefully will complete and improve the existing testing offered.

INTEGRATIVE APPROACH FOR LATE / PERSISTENT / CHRONIC TICK-BORNE INFECTIONS

In order to offer better management of patients with late/chronic and/or persistent infections that are very difficult to uncover, R.E.D. Laboratories (www.redlabs.com) focuses on an integrative approach, inclusive of both direct pathogen detection as well as indirect supportive tests. The overall high failure rate of TBI-related testing, especially in late / persistent / chronic patients, underscores the necessity to focus on the patients’ self-reported symptoms and consider and fully investigate any potential dysregulations and disabilities resulting from these TBI.
Chronic TBDs can mimic every disease process including chronic fatigue syndrome (myalgic encephalomyelitis), fibromyalgia, autoimmune conditions, including sero-negative rheumatoid arthritis and MS, psychiatric conditions, including depression and anxiety, and significant memory and concentration problems that mimic early dementia. It is for this reason it was called the “Great Imitator“ by Dr. Richard Horowitz, in his book, “Why Can’t I Get Better”.
Persistent TBIs have been reported for many autistic patients (Bransfield et al. 2008; Kuhn et al. 2012; Kuhn & Bransfield 2014). Indeed, many specialized physicians focus on TBDs when assessing autism-spectrum disorders.
If an individual has any chronic health condition, ranging from arthritis to chronic fatigue syndrome to fibromyalgia, it is important to rule out or diagnose Lyme disease. It is apparent that many cases of fibromyalgia and chronic fatigue syndrome are actually Lyme disease in disguise (Nicolson & Nicolson 1998).

Chronic Lyme sufferers also frequently house “co-infections” such as Mycoplasma, Chlamydias, Ehrlichia, Bartonella and Babesia. These are different types of “bugs” that enjoy the company of B. burgdorferi.
Patients with Lyme and TBDs may present primarily with gastrointestinal (GI) manifestations. These patients may have complex or persistent GI symptoms involving the upper, mid, or lower GI tract. The number of patients presenting with such symptoms is probably reaching epidemic proportions (Dr. Rahbar, ILADS Conference Augsburg 2015). Testing for gastrointestinal problems need to be included.

Accordingly, the initial integrative panel focuses on:
–  Borrelia serology IgG & IgM (immunoblot)

This is an immunoassay (immunoblot) for the detection of IgG and IgM antibodies against Borrelia burgdorferi in human serum, plasma or CSF. It detects antibodies against four immunopathogenic genospecies (B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzelii, B. spielmanii and B. bavariensis). Precisely, it enables detection of p100, VisE, p58, p41, p39, OspA (without distinction of genospecies), OspC from all genospecies and p18 from all genospecies. The goal of the test is not to distinguish genospecies but to offer the largest coverage in terms of Lyme disease detection.
– Chlamydia serology IgG & IgA/M (immunoblot)
This is an immunoblot for the detection of IgG and IgA antibodies against Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae and Chlamydophila psittaci. Of note, ticks do not carry Chlamydia but Chlamydias are reactivated with tick-borne infections.
– Yersinia serology IgG & IgA/M (immunoblot)
An immunoblot for the detection of IgG and IgA antibodies against all pathogenic Yersinia by means of Yersinia outer proteins (YOPs). Serological differentiation of Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis infections is possible for the first time with the use of new species-specific Yersinia antigens (PsaA, MyfA).
– Babesia FISH Test: Immunofulorescence in situ detection of Babesia infection
– PCR testing Mycoplasma infections
Ticks have been found to carry Mycoplasmas. These infections are exacerbating, particularly in chronic patients, and especially those with autoimmune manifestations. Mycoplasma spp. cause B cells to be overstimulated, promoting autoimmune and Rheumatoid Disease. Mycoplasma increase production of IL-1beta & IL-6.
– An activity test (LTT-MELISA or ELISPOT LTT)
– CD57 absolute cell count
CD57⁺/CD3^– cells are a subset of NK cells. The absolute number of CD57⁺/CD3^– cells is low in patients suffering from chronic Lyme disease. Patients with very low CD57 have significantly more co-infections and persistent immunologic defects than patients with higher counts.
– PGE2 levels
PGE2 is a compound derived from membrane phospholipids, is also a key mediator of immunopathology in chronic infections and cancer. PGE2 enhances its own production but suppresses acute inflammatory mediators, resulting in its predominance at late/chronic stages of immunity. PGE2 selectively suppresses effector functions of macrophages and neutrophils and the Th1-, CTL-, and NK cell-mediated type 1 immunity, but it promotes Th2, Th17, and regulatory T cell responses. PGE2 is observed as significantly upregulated in chronic TBD patients (Professor De Meirleir, ILADS workshop Antwerp 23/4/2016).
-IL-8
When Borrelia migrates, a multisystemic inflammation is initiated. Chemotaxis is exerted by IL-1 and TNF alpha. This migration induces upregulation of cytokines, e.g. IL-8. IL-8 is observed as very significantly upregulated in chronic TBD patients (Professor De Meirleir, ILADS workshop Antwerp 23/4/2016).
– sCD14
CD14 is expressed in monocytes/macrophages and plays a critical role in the recognition of bacterial cell wall components (LPS). The extracellular part of CD14 can be cleaved and released in the plasma, where it will inactivate circulating LPS. Serum soluble CD14 levels are significantly elevated in patients with inflammatory bowel disease and Crohn’s disease, but also in patients suffering from Brucellosis or Lyme disease. Patients with early or untreated late Lyme disease had significantly higher levels of sCD14 than did healthy controls (Lin et al.  2000).
– VEGF
VEGF plays a significant role in pathological conditions that are associated to autoimmune diseases such as in systemic lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis (RA), and multiple sclerosis (MS). Abnormally high levels of VEGF in a mold-free environment would suggest Bartonella infection (Kempf et al. 2001).
– CD38
CD38, which has an important role in dendritic cells (DC) chemotaxis and migration to lymph nodes, was strongly up-regulated by LPS but practically not at all by Borrelia garinii (mostly inducing neuroborreliosis). This finding was confirmed with quantitative RT-PCR and with flow cytometry at the protein level. In addition, RT-PCR showed that CCR7 (shown to stimulate dendritic cell maturation) expression was 11-fold greater in LPS-stimulated than in Borrelia garinii-stimulated cells. These findings suggest that Borrelia garinii may affect crucial DC functions by blocking the up-regulation of important molecules in DC migration to lymph nodes, thus affecting further immune responses in Lyme borreliosis infection (Hartiala et al. 2007). Furthermore, to determine whether the inability of B. garinii to induce CD38 expression would be related to other B. burgdorferi genospecies as well, Hartiala and colleagues (J Immunol. 2010) stimulated DC with B. burgdorferi sensu stricto and B. afzelii. Neither of these Borrelia genospecies induced CD38 upregulation.

-Tests for gastrointestinal problems

1. MSA stool test

R.E.D. Labs scientists have developed and validated a new procedure to analyze bacterial populations in a stool sample: the MSA assay is a new molecular technique involving sequencing of specific regions of bacterial DNA (metagenomics). This test can be performed on dead organisms (exposure to oxygen and freezing are not a problem). Until recently, research into microbiota composition relied almost exclusively on culture, while (i) 40 to 80% of gut bacteria cannot be cultured, (ii) identification of colonies can be difficult, (iii) bacteria must be alive: studies of anaerobes very difficult, major loss during collection and processing of samples, (iv) culture approach may address only a small fraction of all bacterial species (10%?). In contrast, identification of each bacteria by comparing sequence with public databases is extremely precise, not subjective, and high-throughput technology allows identification of tens or even hundreds of organisms in a single sample.

2. Calprotectin in stool

Calprotectin is a neutrophil cytosolic protein with antimicrobial properties, which is present at increased concentration in stool during bowel inflammation.

3. D-lactate in serum

D-lactate is a product of bacterial metabolism, it is neither produced nor metabolized by mammalian cells. Typically, elevated D-lactate levels are due to bacterial infection or short bowel syndrome in humans. Due to slow metabolism and excretion, high D-lactate can cause acidosis and encephalopathy.
Given that persistent infections promote significant damage to the body, which need to be repaired, the following tests should also be considered for a broader integrative approach focusing not only on the identification of causal infection but also on global damages:
-Testing for Tularemia (search for antibodies against Francisella tularensis)
-Testing for Brucellosis (BrucellaCapt assay is very sensitive and specific)
-Testing for Coxsiella, Anaplasma, Rickettsia, Bartonella (PCRs and/or serology)
-Testing for EBV (preferably by immunoblot and PCR)
-Testing for Herpesvirus infections (HHV6)
-Testing for MOLD infections (especially Candida)
-Testing for inflammation (cytokine levels (see Grab et al. 2007) and oxidative stress) :

Inflammation creates free radicals and oxidative stress which damages cell membranes, mitochondria, and nerve cells, creating the “sickness syndrome” (fatigue, pain, cognitive dysfunction, mood disorders).
-Testing for complement (C3a and C4a): C4a appears to be a valuable immunologic marker in patients with persistent symptoms of Lyme disease (Stricker et al. 2009).
– Testing for heavy metals poisoning and nutritional deficiencies (minerals, vitamins, etc).
– Testing for toxic metabolites (Ammonia, Kynurenic and Quinolinic acids).
– Testing for autoantibodies for connective tissue diseases (ANA/ENA immunoblots).
– Testing for leaky gut (Zonulin in stool, antibodies against intestinal bacteria in serum)
IgA/IgM against intestinal bacteria: an antibody screening assay for antibodies (IgA and IgM) directed against antigens from intestinal pathogens. IgA are secreted from intestinal cells, IgM are produced by immune cells in the blood. In healthy individuals pathogenic bacteria are only found in low quantities in the gut, and antibody titers in the blood are very low. However, in the case of bacterial overgrowth (dysbiosis), large quantities of IgA are produced and some IgA will be found in the bloodstream. In case of leaky gut, bacterial proteins may make their way to the bloodstream, and specific IgM will be produced. Therefore, a high titer of IgM for intestinal bacteria is an indicator of increased intestinal permeability.
ZONULIN ELISA tests in stool: Zonulin modulates the permeability of tight junctions between cells of the wall of the digestive tract. As the Zonulin level rises, the seal between the intestinal cells diminishes, opening up spaces between cells that allow numerous macromolecules to pass right through.  This is called “leaky gut”.
– Testing for intestinal inflammation (sIgA, EDN/EPX, beta-defensin-2)
sIgA ELISA tests in stool samples:  sIgA key function is to bind to invading microorganisms and toxins and entrap them in the mucus layer or within the epithelial cells, so inhibiting microbial motility, agglutinating the organisms and neutralizing their exotoxins and then assist in their harmless elimination from the body in the fecal flow. The concentration of sIgA gives us information about the intestinal immune defense: a lack of sIgA indicates a diminished activity of the intestinal immune system, an increased level of sIgA shows intestinal inflammation.
EPX/EDN ELISA tests in stool samples: The accumulation of EDN in the intestine is associated with inflammation and tissue damage. Measuring of EDN in stool can serve as an objective parameter for a current clinical or sub-clinical chronic inflammation located in the gastrointestinal area. Fecal EDN is considered the best of the cytotoxic granule proteins for assessment of gut inflammation, as it most accurately reflects clinical, endoscopic, and histologic scores of disease activity and mucosal damage. Elevated levels of fecal EDN are linked to multiple inflammatory conditions, like food allergy/sensitivity, pathogenic infections (C. difficile and H. Pylori), IBS, and Eosinophilic Gastrointestinal Disorders.
ß-defensin-2 ELISA tests in stool samples: The ß-defensins are an integral part of the congenital immune system and contribute through their antimicrobial effect to the barrier function of intestinal epithelial cells. Defensins exert a variable degree of antimicrobial activity against bacteria, fungi, and some enveloped viruses.  The expression of ß-defensins is induced by pro-inflammatory cytokines and also through microorganisms (e.g. E. coli, H. pylori or P. aeruginosa) and by probiotic microorganisms. A ß-defensin-2 deficiency can, for example, be observed in the intestinal mucous of patients with Crohn’s disease. The defense system of the mucous membrane is therefore restricted and allows an increased invasion of bacteria, which could possibly lead to a typical infection in Crohn’s disease patients. Recent results imply that ß-defensin-2 is overexpressed in active intestinal inflammation, especially in ulcerative colitis.
These are not the only tests that might be useful to consider for an integrative approach. Based on clinical examination, the physician will select other ones that might apply. A wide range of potentially useful considerations are listed in the books from Dr Horowitz. Specialized medical and scientific conferences are also a great source of valuable information.

Future Possibilities for Diagnostic Tests

Because treatment is more effective in the early stages of Lyme disease, there is a great need to develop simple, fast and accurate diagnostics to determine whether people have been infected. According to the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), “NIAID-supported scientists have identified genome sequences of multiple strains of B. burgdorferi. Greater advances in diagnostics are anticipated as genetic information is combined with advances in microarray technology, imaging, and proteomics. These growing fields of science are expected to lead to improved diagnostic tools as well as provide new insights on the pathogenesis of Lyme disease. Examples of future tools being developed with NIAID support include use of metabolomics to characterize new biomarkers of infection, next generation T-cell based measurements, and novel antigens for improved measurement of effective treatment.”
TickPlex, a new nanotechnology-based method from a Finnish group, is currently being elaborated as a multiple infection diagnostic tool.
Some recent developments, that are almost ready to be included in the testing panels, are the HybriSpot technique (from Master Diagnostica) with their TICK-BORNE BACTERIA FLOW CHIP that allows the simultaneous detection (by PCR and blot) of 7 tick-borne bacteria genera: Rickettsia, Erhlichia, Anaplasma, Francisella, Bartonella, Borrelia and Coxiella. This technique is compatible with human, animal, and tick samples. While extremely promising, the technique still does not offer good reproducibility, showing lot-to-lot differences and flaws when multiple bacterial types are mixed together.
Finally, with increasing attention that is granted today to TBI, existing tests (like PCRs) are also constantly improved and are leading to better results.
Sharing the information and spreading the knowledge is the very first step towards improved testing.

FINAL REMARKS

Summarizing TBI-related testing is a huge enterprise. Many articles, books, websites, blogs, etc are available today (see below a short selection), and multiple conferences are held each year. The goal of the present contribution was to put some of this information together as a convenient resource for patients in order to promote an understanding of the usefulness but also the limitations of available tests and the underlying reasons of failure. The final aim was also to further emphasize the need for a global, integrative approach for a better management of TBIs.

https://www.lymeepidemie.nl/tick-borne-disease-related-testing/?lang=en
-------------------------------------

 Czułość ELISPOT do wykrywania limfocytów T wytwarzających cytokiny jest 20 do 200 razy większa niż czułość ELISA [ 29 ]. Technologia ELISPOTokazała się niezwykle czuła w wykrywaniu nawet niskich częstotliwości komórek T reagujących na antygen i została zatwierdzona przez FDA do stosowania w diagnostyce gruźlicy [ 30 , 31 ]. Tutaj badamy potencjalne zastosowanie naszego nowo opracowanego testu Lyme ELISPOT oraz iSpot Lyme, jako narzędzia diagnostycznego do wykrywania boreliozy z Lyme.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3972671/?fbclid=IwAR2aIE0k3fLkwwizjZ4YMRR_8S9wbMBfHZMPN2sYkOtBRvLvpSU3zhB3FUQ
-------------------
Niewiarygodnosc testow Elisa i Wb przy diagnozowaniu boreliozy

http://boreliozaabc.blogspot.com/2016/03/badania-niewiarygodnosc-testow-elisa-i.html